俞潔雅，倪夢萍，丁良長，胡洲銘，肖建中，鄭 強(qiáng)，*

(麗水學(xué)院 a. 教師教育學(xué)院; b. 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000)

我國是禽畜養(yǎng)殖大國，畜牧業(yè)已成為我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。同時，畜禽養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量糞便對環(huán)境造成的嚴(yán)重污染引發(fā)社會的廣泛關(guān)注，是我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中迫切需要解決的重大問題[1]。根據(jù)《第一次全國污染源普查公報》顯示，畜禽糞便中化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand，COD)、總氮、總磷的產(chǎn)生量分別為1 268萬t、106萬t和16萬t，分別占農(nóng)業(yè)污染源產(chǎn)生量的96%、38%、65%[2]，畜禽糞便的無害化處理迫在眉睫。

常用的禽畜糞便處理方法包括化學(xué)處理法、物理處理法與微生物發(fā)酵法等[3]?；瘜W(xué)處理法對豬糞的除臭與分解效率高，但設(shè)備運(yùn)行及維護(hù)成本高昂[4]；物理處理法存在前期投入成本巨大、處理效率較低、易造成二次污染等缺點(diǎn)[5]。微生物發(fā)酵法是利用土壤中微生物或添加的外源微生物的作用，將畜禽糞便中復(fù)雜的、不穩(wěn)定的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成簡單、穩(wěn)定的有機(jī)質(zhì)，同時釋放出速效養(yǎng)分供作物利用的方法，尤其是基于微生物發(fā)酵床的處理模式，具有高效、清潔、安全、維護(hù)方便及運(yùn)行成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。微生物發(fā)酵床是以谷殼、秸稈、鋸糠、椰糠等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為墊料層，禽畜養(yǎng)殖于其上，墊料與豬糞尿等排泄物混合后經(jīng)微生物發(fā)酵，從而消納糞便、去除異味，實(shí)現(xiàn)無害化養(yǎng)殖的新型環(huán)保養(yǎng)豬技術(shù)[8]。微生物發(fā)酵床墊料中的微生物消納處理畜禽糞便，細(xì)菌在降解過程中起重要作用。目前常用的發(fā)酵菌劑主要源于進(jìn)口[9]，其使用成本高；國內(nèi)自主培育的菌劑商品化程度不高，且普遍表現(xiàn)出除臭不徹底、豬糞腐熟緩慢等缺點(diǎn)，從而導(dǎo)致發(fā)酵床的處理容量低、周期長、難以實(shí)現(xiàn)零污染排放[10]。

本研究采用氨選擇培養(yǎng)基從土壤中篩選出能夠利用氨作為唯一氮源的菌株，通過監(jiān)測豬糞發(fā)酵過程中NH3與H2S的釋放量對其實(shí)際除臭效果進(jìn)行評價，并采用種子發(fā)芽指數(shù)評價篩選菌株對促進(jìn)豬糞堆肥腐熟的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

土壤樣品采自浙江省麗水市蓮都區(qū)白云山森林公園，選擇落葉覆蓋的富含腐殖質(zhì)的土樣。豬糞采自麗水某規(guī)?；B(yǎng)豬場，自然風(fēng)干。

1.1.2 培養(yǎng)基

參考文獻(xiàn)[11-13]，配制以下培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂16.0 g，蒸餾水1 000 mL。NH3選擇性液體培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g，氨水10.0 mL，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，1% ZnSO45.0 mL，NaCl 2 g，蒸餾水1 000 mL。NH3選擇性復(fù)篩液體培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，NaCl 1.0 g，(NH4)2SO40.6 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，蒸餾水1 000 mL。沙氏液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)真菌)：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，蒸餾水1 000 mL。馬丁氏培養(yǎng)基(保存真菌)：孟加拉紅粉末36 g，蒸餾水1 000 mL。高氏培養(yǎng)基(分離、保存放線菌)：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑

DNS試劑購自青島捷世康生物科技有限公司，對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽購自淮南市科迪化工科技有限公司，其他試劑購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離

在超凈工作臺中稱取10 g土壤樣品，放入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，室溫下150 r·min-1搖床振蕩30 min，然后靜置20 min，制得10-1的土壤懸液。取土壤懸液進(jìn)行梯度稀釋，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6等不同稀釋倍數(shù)的土壤懸液。吸取各土壤懸液200 μL分別涂布于高氏1號固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)菌形態(tài)，選擇形態(tài)不同且長勢優(yōu)良的菌落進(jìn)行分離純化。

1.2.2 除氨微生物的篩選

將分離的菌種接入NH3選擇性液體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，搖床培養(yǎng)，若菌液渾濁則說明該菌種能利用NH3，反之則不能。將初篩得到的菌種搖瓶培養(yǎng)，制備菌懸液，按10%的接種量接入含有100 mL NH3選擇性復(fù)篩液體培養(yǎng)基的大試管中，加入1 mL質(zhì)量濃度為0.898 g·mL-1的濃氨水，大試管內(nèi)懸掛一個裝有10 mL的1%硼酸的小容器吸收氨氣，對照組(NC)加入等量無菌水。將大試管置于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d后檢測硼酸吸收液中的NH3含量及大試管中殘留的NH3含量。每個處理3個重復(fù)，結(jié)果取3個重復(fù)的平均值。根據(jù)以下公式計算氨氮降解率：

氨氮降解率(%)=(初始氨氮含量-殘余氨氮含量)÷初始氨氮含量×100%。

1.2.3 豬糞NH3與H2S釋放量測定

將篩選到的菌株接入裝有400 g新鮮豬糞的大燒杯中，豬糞表面放入一只裝有20 mL 2%硼酸的小燒杯，用于吸收釋放的NH3。對照組(NC)不接種菌株。用保鮮膜將杯口密封，置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。NH3釋放量按照凱氏滴定法[14]進(jìn)行測定。進(jìn)行H2S釋放量測定，小燒杯中放入20 mL的鋅胺絡(luò)鹽溶液，按照鋅胺絡(luò)鹽吸收比色法[15]測定H2S釋放量。

1.2.4 種子發(fā)芽試驗(yàn)

稱取10 g接菌發(fā)酵后的豬糞，加入90 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?00 r·min-1搖床振蕩30 min，經(jīng)紗布過濾后，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，取15 mL上清液倒入底部鋪墊濾紙的培養(yǎng)皿中，均勻放入20粒花菜種子。樣品置于20 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h后，測定花菜種子發(fā)芽率和根長，同時用未接菌豬糞濾液作陽性對照，蒸餾水作陰性對照[16-17]。種子發(fā)芽指數(shù)(germination index，GI)計算公式為：

GI(%)=(處理種子發(fā)芽率×處理種子根長)/(對照平均發(fā)芽率×對照種子根長)×100%。

1.2.5 分離株鑒定

分離株形態(tài)觀察和生理生化特性測定按《一般細(xì)菌常規(guī)鑒定方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。參考GB20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》和QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》對分離菌株進(jìn)行鑒定，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力采用紫外分光光度法測定，糖化酶活力采用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法測定，脂肪酶活力采用酸堿滴定法測定，纖維素酶活力按照DNS法測定。

提取分離株DNA，利用通用引物擴(kuò)增菌株16S rDNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，并送至上海生工生物工程有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，使用Blast搜索程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行BLAST同源檢索，從而在分子水平上對菌株進(jìn)行種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 除NH3微生物初篩

利用NH3選擇性培養(yǎng)基共篩選到菌株49株，其中細(xì)菌(X)13株、真菌(Z)18株、放線菌(F)18株，NH3降解率33.8%～74.1%(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，X3、X7、Z6、Z10、Z16、F6和F18對NH3的降解率分別為72.0%、74.1%、70.9%、72.4%、71.2%、70.7%和74.0%。由于NH3選擇性培養(yǎng)基以NH3作為唯一氮源，因此上述7株菌理論上具有消化氨氮、減少豬糞發(fā)酵過程中NH3釋放的功能。

2.2 除NH3微生物復(fù)篩

將7株菌分別接種至含水量約為50%的豬糞中，培養(yǎng)2周后，測定氨氣累積釋放量(圖2)。如圖所示，與不接菌對照組(NC)相比，7株菌接種處理后豬糞NH3釋放量均下降，Z10接種豬糞后NH3釋放量下降最多，釋放量為35.66 mg·kg-1。

2.3 Z10菌株除臭效果評價

豬糞臭氣源主要成分是NH3和H2S，對Z10菌株除臭效果評價見圖3。如圖所示，處理21 d內(nèi)，Z10處理組NH3和H2S累計排放量均低于對照組。處理21 d后，對照組NH3和H2S累計排放量分別為131.57、4.45 mg·kg-1，Z10處理組NH3和H2S累計排放量分別為80.71、2.22 mg·kg-1，較對照組顯著降低。

圖1 分離菌株NH3降解率Fig.1 Degradation rate of NH3 in isolated strains

圖2 氨氣累積釋放量Fig.2 Cumulative release of ammonia

圖3 Z10菌株除臭效果評價Fig.3 Evaluation of deodorant effect of Z10

2.4 種子發(fā)芽試驗(yàn)

種子發(fā)芽指數(shù)是目前評價堆肥腐熟度及植物毒性的最可靠的指標(biāo)[16]。從圖4可知，豬糞未接菌處理的對照組發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)分別為68.35%、59.12%，說明不接菌發(fā)酵時，21 d發(fā)酵無法達(dá)到腐熟、無害化的要求，植物毒性較大，對種子發(fā)芽率有較大的抑制。Z10組發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)分別為83.33%、88.55%，由于發(fā)芽率超過80%可認(rèn)為豬糞對種子基本無毒害，可見Z10菌株接種處理對豬糞腐熟及無害化具有顯著的促進(jìn)作用。

2.5 分離株生化性質(zhì)及鑒定

為了進(jìn)一步揭示Z10菌株降解豬糞的生化性質(zhì)，分別測定了其蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶和纖維素酶的活力。研究發(fā)現(xiàn)，3種蛋白酶活性未檢測到，α-淀粉酶、脂肪酶、糖化酶和纖維素酶活性分別為3.902、19.261、27.062、232.543 U·mL-1。由此可知，Z10菌株的豬糞分解能力主要基于其較強(qiáng)的纖維素酶活性，淀粉酶、脂肪酶、糖化酶活性可能發(fā)揮了一定程度的作用。通過BLAST搜索，將Z10菌株與NCBI數(shù)據(jù)中收錄的同源性較高的菌株進(jìn)行同源性比對，同源菌株名稱及GenBank注冊號見表1。分子鑒定結(jié)果顯示，Z10菌株為煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)。

圖4 種子發(fā)芽試驗(yàn)Fig.4 Seed germination experiment

表1 同源菌株比對

Table 1 Homologous strain alignment

菌株名稱Name同源性 homology/%注冊號GenBankNo.Aspergillus fumigatus strain MS13.1100MK329206.1Aspergillus fumigatus isolate RS_20100MK267099.1Aspergillus fumigatus strain TZT-18-24100MH919847.1Aspergillus fumigatus strain MF22509100MH911420.1Aspergillus fumigatus strain MF22415100MH911416.1Aspergillus fumigatus strain MF22480100MH911400.1Aspergillus fumigatus strain MF22397100MH911397.1Aspergillus fumigatus strain MF22500100MH911384.1Aspergillus fumigatus strain MF22502100MH911377.1Aspergillus fumigatus strain MF22449100MH911361.1

3 討論

微生物發(fā)酵床具有降解糞污的作用，其中的微生物起到能量轉(zhuǎn)化的作用，將糞污轉(zhuǎn)化為無植物毒性的有機(jī)養(yǎng)分[18]。添加的菌株必須在豬糞除臭與促進(jìn)豬糞腐熟兩個方面發(fā)揮作用，這樣才可能真正做到低排放及保證發(fā)酵床的糞污消納量。

本研究利用NH3選擇性培養(yǎng)基，從土壤中篩選能夠利用氨作為唯一氮源的微生物，獲得的菌株具有一定的轉(zhuǎn)化豬糞中氨氮從而降低氨氣釋放量的潛力。由于豬糞中有機(jī)氮轉(zhuǎn)化過程較為復(fù)雜，涉及銨態(tài)氮與硝態(tài)氮等不同氨氮類型，同時還有氨氧化細(xì)菌、硝化細(xì)菌及反硝化細(xì)菌等其他不同類型菌株參與[19]，菌株對培養(yǎng)基中無機(jī)氮的利用能力與對豬糞中有機(jī)氮的吸收轉(zhuǎn)化能力之間的相關(guān)性并非線性，因此在實(shí)際應(yīng)用中，培養(yǎng)基篩選出的X7與F18菌株除臭效果低于Z10。

NH3與H2S是豬糞惡臭氣味的主要來源，是豬糞中含氮化合物及含硫化合物在厭氧條件下由雜菌作用產(chǎn)生[20]。通過監(jiān)測豬糞發(fā)酵過程中NH3與H2S的釋放量可真實(shí)地評估豬糞發(fā)酵菌株的除臭效果。不同的豬糞發(fā)酵菌株對NH3與H2S的抑制效果差異顯著。許啟有等[21]篩選的短桿菌株、副球菌株對NH3與H2S的去除率分別為46.6%、6.8%與5.6%、54.4%；陳麗園等[22]篩選的菌株使豬糞NH3和H2S的釋放量降低67.95%和26.6%，其抑制NH3釋放的效果較明顯，但對H2S的作用效果不佳。張生偉[10]篩選的菌株BX3對NH3與H2S的去除率分別達(dá)到80.07%和76.92%，對兩者的抑制效果都很顯著。本研究中，篩選的Z10菌株使豬糞NH3與H2S的釋放量分別降低38.66%與50.03%。

糞便發(fā)酵過程受到有機(jī)物含量、碳氮比、水分含量和氧氣供給量等多種因素的影響，添加的外源微生物接種劑對發(fā)酵有良好的促進(jìn)效果。研究發(fā)現(xiàn)，畜禽糞便發(fā)酵后，GI值達(dá)到50%時，發(fā)酵糞便的植物毒性較弱，當(dāng)GI值超過80%時，發(fā)酵糞便的植物毒性基本消除[23]。本研究中，Z10菌株處理豬糞后，種子發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)與不接菌的陰性對照相比都有了較為顯著的提高，說明添加的Z10菌株能夠加速豬糞中植物毒性物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，加快豬糞的腐熟與無害化進(jìn)程；Z10組GI值甚至高于陽性對照，推測微生物分解有機(jī)物質(zhì)過程中產(chǎn)生了一些生理活性物質(zhì)，刺激了胚根的生長。

本研究中篩選得到的Z10菌株最終鑒定為煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)。Z10菌株具有極強(qiáng)的纖維素酶活力，可有效降解豬糞中的粗纖維，加速豬糞腐熟作用，抑制NH3與H2S的釋放。煙曲霉菌是自然界廣泛存在的一種真菌，目前尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外關(guān)于煙曲霉菌用于豬糞發(fā)酵的相關(guān)報道，煙曲霉對豬糞的除臭及促腐熟效果的評價也較少。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉分泌的煙曲霉素對多種病原微生物具有較好的防治作用，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)、養(yǎng)殖領(lǐng)域[25]，推測煙曲霉菌在豬糞發(fā)酵過程中分泌的煙曲霉素對某些產(chǎn)生臭味物質(zhì)雜菌的滋生起到一定的抑制作用，從而減少了臭氣的釋放。該菌株可能為開發(fā)新型的豬糞發(fā)酵復(fù)合菌劑提供備選菌株。然而，目前鮮有分泌抗生素的菌株用于發(fā)酵床的安全性評估研究。因此，該菌株是否能真正應(yīng)用于發(fā)酵床，以及如何進(jìn)行相應(yīng)的安全性評價有待進(jìn)一步研究。