胡小龍，姜 峰，張 敏，王月榮，章弘揚(yáng)，胡 坪?

（1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，在我國(guó)已經(jīng)有兩千多年的藥用歷史。厚樸中含有大量木脂素、苯乙醇苷類化合物［1-2］，其中的magnoloside A 也稱為木蘭苷A、厚樸苷A，是藥材中最主要的苯乙醇苷類化合物之一，具有良好的抗菌［3］、抗氧化［4］能力，可用于乙酰膽堿抑制劑［5］。

從中藥有效成分中開(kāi)展新藥研發(fā)，是中藥現(xiàn)代化重要途徑。目前，對(duì)厚樸中主要活性成分厚樸酚、和厚樸酚的分離、活性、質(zhì)量研究相對(duì)較多，而鮮有涉及magnoloside A，這是由于它一般采用制備色譜分離，分離過(guò)程復(fù)雜［1，4，6］，對(duì)照品價(jià)格貴，不易獲得。

高速逆 流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是由Ito［7］博士于1966 年提出的一種液液分配色譜，無(wú)需固體支持，進(jìn)樣量較大，被廣泛應(yīng)用于抗生素、蛋白質(zhì)、農(nóng)藥、天然產(chǎn)物［8-11］等分離、制備及分析中，已有研究將該方法應(yīng)用于厚樸中厚樸酚、和厚樸酚的分離制備［12-13］。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)HSCCC 法對(duì)厚樸粗提物中的magnoloside A 進(jìn)行分離制備，以期為該成分后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

TEB 300C 高速逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；PB1501-N 精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FD-1A-50 冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DLSB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海予華儀器有限公司）；實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀、Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國(guó)Agilent 公司）。

magnoloside A 對(duì)照品（自制）。厚樸由河北神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，產(chǎn)地四川都江堰，經(jīng)華東理工大學(xué)胡坪教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮。甲醇為色譜純，購(gòu)于美國(guó)ACS 公司；甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇等為分析純，購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸粗提物制備 稱取藥材100 g，加入80% 乙醇1 000 mL回流提取2 h，提取液減壓濃縮至100 mL，等體積正己烷萃取3 次，棄去正己烷相，水相再用等體積水飽和正丁醇萃取3 次，合并正丁醇相，減壓濃縮至干，加水復(fù)溶后冷凍干燥，即得（8.8 g），得率為8.8%。

2.2 magnoloside A 含有量測(cè)定［14］色譜條件為Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相醋酸（pH＝3.0）（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～40 min，19%～35% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)328 nm；體積流量1 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。粗提物色譜圖見(jiàn)圖1。

由此可知，圖中色譜峰數(shù)較多，組成較為復(fù)雜，以自制的magnoloside A 為對(duì)照品，測(cè)得粗提物中該成分含有量為14.3%，回收率為79.5%。稱取一定量粗提物，加入溶劑系統(tǒng)的下相溶劑15 mL，超聲溶解，即得HSCCC 樣品溶液。

圖1 厚樸粗提物HPLC 色譜圖

2.3 溶劑體系篩選 影響HSCCC 分離效果的因素較多，以溶劑體系最為主要。合適的溶劑體系應(yīng)具備以下特性：樣品在兩相中有合適的分配系數(shù) ［一般認(rèn)為分配系數(shù)（K值）應(yīng)該在0.5～2 范圍內(nèi)］；兩相有較短的分層時(shí)間；兩相對(duì)樣品的溶解度良好，并且不造成其分解變性［15］。在篩選溶劑體系時(shí)，主要考察添加樣品后溶劑分層時(shí)間與成分在上下相的K值，公式為K＝CS／CM，其中CS、CM分別為目標(biāo)成分在上、下相中的含有量。

本實(shí)驗(yàn)借鑒苯乙醇苷類化合物常見(jiàn)的HSCCC 分離體系［16-18］，結(jié)合magnoloside A 極性，選擇乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水作為分離體系，考察其不同比例對(duì)magnoloside AK值的影響。取約2 mg 樣品，加入待考察溶劑系統(tǒng)2 mL，搖勻，靜置分層，取下相進(jìn)行HPLC 分析；再取一定體積上相，氮?dú)獯蹈?，甲醇?fù)溶，進(jìn)行HPLC 分析，測(cè)量目標(biāo)成分在兩相中的含有量，計(jì)算K值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 magnoloside A 在不同溶劑體系中的K 值

由此可知，溶劑系統(tǒng)2、4 的K值大于3，會(huì)使magnoloside A 在體系內(nèi)保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，從而增加分離時(shí)間和溶劑消耗量，其余溶劑體系都比較適合。但由于厚樸提取物成分較復(fù)雜，溶劑體系1 的K值過(guò)小，magnoloside A 與相鄰雜質(zhì)分離度較差；溶劑體系3、5 對(duì)magnoloside A 的分離效果較好，考慮到節(jié)省溶劑和時(shí)間，最終確定的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1∶1∶0.2∶2）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)前，在分液漏斗中加入上述兩相溶劑體系，劇烈振搖使其充分混合，靜置分層，上、下相各超聲脫氣20 min，分別作為固定相、流動(dòng)相，備用。

2.4 流動(dòng)相體積流量及儀器轉(zhuǎn)速優(yōu)化 在HSCCC 實(shí)際操作過(guò)程中，流動(dòng)相體積流量和儀器轉(zhuǎn)速會(huì)在很大程度上影響固定相保留率。而保留率越高，化合物萃取越充分，所得化合物純度也越高。

本實(shí)驗(yàn)固定體系溫度為25 ℃，選擇轉(zhuǎn)速700、850、900 r／min，分別以體積流量3、4、5、7 mL／min 泵入流動(dòng)相直至體系平衡，計(jì)算固定相保留率，以固定相的保留率和體積流量的平方根作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，不同轉(zhuǎn)速下方程線性關(guān)系良好，與文獻(xiàn)［19］報(bào)道相符；當(dāng)轉(zhuǎn)速為850 r／min、體積流量為3 mL／min 時(shí)，固定相保留率最高。

圖2 不同轉(zhuǎn)速下體積流量平方根與保留率之間的關(guān)系

2.5 體系溫度篩選 HSCCC 體系的溫度對(duì)固定相保留率也有一定影響。固定轉(zhuǎn)速850 r／min、體積流量3 mL／min，選擇體系溫度25、30、35、40、45 ℃，泵入流動(dòng)相直至體系平衡，計(jì)算固定相保留率，以溫度和保留率作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，適當(dāng)提高溫度在一定程度上可增加固定相保留率，與文獻(xiàn)［16］報(bào)道一致；但溫度過(guò)高會(huì)影響化合物穩(wěn)定性，同時(shí)會(huì)造成固定相一定程度的揮發(fā)，故選取45 ℃作為最佳柱溫，保留率為73.3%。

圖3 溫度與保留率之間的關(guān)系

2.6 樣品進(jìn)樣量篩選 進(jìn)樣量增大有利于提高制備通量，但同時(shí)也可能引起超載，使色譜峰展寬，分離度下降，化合物純度降低。取厚樸粗提物500、750、1 000 mg，溶于15 mL 下相中，在優(yōu)化的分離條件下比較不同進(jìn)樣量時(shí)目標(biāo)化合物在HSCCC 色譜圖上的分離度，并以其純度和產(chǎn)率為指標(biāo)篩選進(jìn)樣量，結(jié)果見(jiàn)圖4、表2。由圖4 可知，進(jìn)樣量由500 mg 升至1 000 mg時(shí)，magnoloside A 與其他組分的分離度仍較好；由表2 可知，不同進(jìn)樣量下magnoloside A純度和產(chǎn)率都比較接近，故可采用較大的進(jìn)樣量。另外，若只收集峰頂部分的餾分，則純度可大于98%。

圖4 magnoloside A 流出曲線

表2 不同進(jìn)樣量下magnoloside A 產(chǎn)率、純度測(cè)定結(jié)果

2.7 magnoloside A 分離純化 以正丁醇-乙酸乙酯-乙醇-水（1∶1∶0.2∶2）上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，采用頭進(jìn)尾出、正轉(zhuǎn)的模式，泵入固定相，待上相完全充滿整個(gè)逆流色譜柱后，打開(kāi)色譜儀，設(shè)置轉(zhuǎn)速850 r／min、體積流量3 mL／min、檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm、溫度45 ℃，將下相泵入螺旋管中，待流動(dòng)相開(kāi)始從檢測(cè)器尾端持續(xù)流出時(shí)，表明螺旋管內(nèi)兩相溶劑達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡。取溶解于下相、質(zhì)量濃度為1 000 mg／15 mL 的厚樸粗提物溶液，通過(guò)進(jìn)樣閥進(jìn)樣，持續(xù)泵入流動(dòng)相開(kāi)始分離。收集206～260 min餾分，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得到化合物121.9 mg，純度達(dá)95.8%（圖5），回收率為81.7%，完成一次進(jìn)樣時(shí)長(zhǎng)為270 min。

圖5 magnoloside A HPLC 色譜圖

2.8 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物為淡黃色粉末，易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑。水溶液中最大吸收波長(zhǎng)為217、290、328 nm。ESI-MSm／z：623 ［M-H］-，分子式為C29H36O15。紅外KBrmax（cm-1）：3 410（OH），1 686（C＝O），1 634（C＝C），1 604，1 523（苯環(huán)）。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：1.27（3H，d，6.1 Hz），2.83（2H，t，6.4 Hz），3.48（2H，t，9.6 Hz），4.11（1H，q，9.2 Hz），4.99（1H，bs），5.80（1H，bs），6.44（1H，d，15.6 Hz），6.73（1H，d，7.6 Hz），6.84（1H，d，7.6 Hz），6.85（1H，bs），6.94（1H，d，7.6 Hz），7.10（1H，d，7.6 Hz），7.18（1H，bs），7.66（1H，d，16.0 Hz）；13C-NMR（400 MHz，D2O）δ：16.52，34.59，60.73，65.19，68.92，69.98，70.07，70.13，70.59，71.84，72.64，74.19，97.04，98.93，113.85，115.09，115.86，116.11，116.49，121.03，122.76，126.76，131.25，142.24，143.79，144.18，146.69，147.16，186.70。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］一致，確定為magnoloside A。

3 討論與結(jié)論

厚樸具有多種藥理作用，而magnoloside A 被認(rèn)為是其活性成分之一，故建立其高效的分離制備方法具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用HSCCC 法對(duì)magnoloside A 進(jìn)行分離純化，它相比于制備液相色譜對(duì)樣品前處理要求低，經(jīng)簡(jiǎn)單的回流提取和萃取富集后即可進(jìn)樣，省去了文獻(xiàn)報(bào)道的柱層析前處理操作，極大簡(jiǎn)化了流程，提高了效率。

在HSCCC 分離研究中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩相溶劑系統(tǒng)、流動(dòng)相體積流量、儀器轉(zhuǎn)速、體系溫度、進(jìn)樣量等參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)在兩相溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1∶1∶0.2∶2）、轉(zhuǎn)速850 r／min、體積流量3 mL／min、溫度45 ℃條件下，固定相保留率高達(dá)73.3%，為后續(xù)實(shí)際樣品的高效分離奠定了基礎(chǔ)。

同時(shí)，HSCCC 法樣品前處理步驟簡(jiǎn)單，分離制備1 次僅需270 min，單次進(jìn)樣量達(dá)1 g，可制備得純度為95.8%的magnoloside A 121.9 mg，逆流分離純化回收率達(dá)81.7%，方法總回收率為65.0%。該方法具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間藥材、產(chǎn)率和回收率高等特點(diǎn)，可大大降低分離成本，為該成分高效制備提供了新方法。