劉丹 李愛華 劉岱松 周波 吳自友 黃凱

摘要?甜菜堿（GB）是植物在脅迫下積累的一種滲透保護(hù)劑。介紹了甜菜堿在植物中的作用機(jī)理，以及高鹽度、干旱、高溫、低溫和重金屬逆境下添加外源甜菜堿或轉(zhuǎn)甜菜堿基因?qū)煵輧?nèi)部相關(guān)變化的研究進(jìn)展，旨在為甜菜堿增強(qiáng)煙草抗逆性和提高品質(zhì)、產(chǎn)量提供參考。

關(guān)鍵詞?甜菜堿;煙草;逆境;甜菜堿醛脫氫酶

中圖分類號?S572文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）07-0011-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.004

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

The?Role?of?Glycine?Betaine?in?Improving?Tobacco?Stress?Resistance

LIU?Dan，LI?Aihua，LIU?Daisong?et?al

（Hubei?Tobacco?Company?Shiyan?City?Company，Shiyan，Hubei?442000）

Abstract?Glycine?betaine（GB）?is?an?osmoprotectant?accumulated?in?plants?under?stress.The?mechanism?of?glycine?betaine?in?plants?and?the?related?changes?under?high?salinity，drought，high?temperature，low?temperature?and?heavy?metal?stress?with?the?addition?of?exogenous?betaine?or?transbetaine?genes?were?introduced?in?tobacco?in?this?paper.This?article?would?provide?a?reference?for?glycine?betaine?to?enhance?stress?resistance?and?quality?yield?of?tobacco.

Key?words?Glycine?betaine;Tobacco;Stress;Betainealdehyde?dehydrogenase

作者簡介?劉丹（1986—），女，四川仁壽人，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草栽培研究。

收稿日期?2019-05-07;修回日期?2019-10-23

煙草不僅是模式植物也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，對鄂西山區(qū)產(chǎn)業(yè)扶貧開發(fā)、農(nóng)民增產(chǎn)增收具有重要作用。煙草在生育期內(nèi)受到生物和非生物脅迫影響較大，高溫、持續(xù)干旱或排水不暢會引起煙苗生長緩慢，生長勢減弱，誘導(dǎo)花葉病、黑脛病、青枯病等根莖類病害發(fā)生。

甜菜堿包括甘氨酸甜菜堿（glycine?betaine）?、丙氨酸甜菜堿（balanine?betaine）?、脯?氨?酸?甜?菜?堿?（proline??betaine）??和?羥?脯?氨?酸?甜?菜?堿（hydroxyproline??betaine）。目前研究和應(yīng)用最多的是甘氨酸甜菜堿（GB）。甘氨酸甜菜堿簡稱甜菜堿，是一種重要的滲透保護(hù)劑，存在于包括細(xì)菌和高等植物在內(nèi)的許多生物體中。在逆境條件下，甜菜堿可以通過降低植物細(xì)胞滲透壓，維持和穩(wěn)定生物體內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)的完整性來提高植物的抗性[1-3]。

研究表明，甜菜堿在植物抵御外界環(huán)境脅迫中起著重要作用，能夠提高植物的耐鹽性[4]、耐冷性[5]、抗凍性[3]、耐光抑制[6]和耐熱性[7-8]。外源甜菜堿同樣提高了玉米[9]和煙草[10-11]對非生物脅迫的耐受性。甜菜堿雖然存在于眾多生物中，但煙草沒有與甜菜堿合成相關(guān)的酶，其自身不能合成甜菜堿[12]。筆者對甜菜堿在提高煙草抗逆性中的作用進(jìn)行闡述，為煙草的耐鹽性、抗高溫干旱、抗寒性及抗金屬性等抗逆性研究提供實(shí)踐依據(jù)。

1?作用機(jī)理

GB是一種典型的相容溶質(zhì)，通常在葉片中積累，以應(yīng)對植物缺水、鹽脅迫以及抗寒等過程。目前證明，GB是由2種不同的底物（膽堿和甘氨酸），分別通過2種不同的途徑合成[13]。在許多生物中，膽堿轉(zhuǎn)化為GB的過程已經(jīng)被研究過，其途徑涉及1～2種酶，這取決于膽堿的氧化方式。這2種酶途徑普遍存在于廣泛的植物、動(dòng)物和微生物中，其中GB是通過有毒的甜菜堿醛2步氧化膽堿而形成的。在高等植物中，由膽堿（CHO）經(jīng)甜菜堿醛（BA）合成了GB。GB生物合成的第一步和第二步酶分別是膽堿單加氧酶（CMO）和甜菜堿醛脫氫酶（BADH）[14]。在調(diào)查的許多植物物種中，編碼2步酶過程的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但積累GB的能力有很大不同。與藜科植物相比，菠菜和甜菜通常在缺水或鹽脅迫下積累大量的GB[15-16]，而同樣條件下，單子葉植物玉米、小麥、高粱和大麥只積累較少的GB（0～20?μmol/g）[17-21]。此外，研究證明，無論是外源施用GB或BA還是轉(zhuǎn)基因植物導(dǎo)入CMO或BADH基因，植物中都可以積累大量的GB，并對鹽脅迫和溫度脅迫有較強(qiáng)的耐受性[22-24]。這說明甜菜堿在植物抗逆性中的作用至關(guān)重要。

2?甜菜堿對煙草的抗逆性

2.1?甜菜堿提高煙草的耐鹽性?世界上約20%的耕地和幾乎50%的灌溉土地受到高鹽度的影響[25]。暴露在高鹽度下會導(dǎo)致生物體內(nèi)離子失衡和高滲透壓。植物利用各種特定的抗鹽機(jī)制來調(diào)節(jié)其內(nèi)部滲透狀態(tài)，其中之一是能夠積累低分子量的有機(jī)相容溶質(zhì)，如糖、某些氨基酸和季銨鹽化合物。甘氨酸甜菜堿（GB）是一種重要的滲透壓物質(zhì)，能有效地穩(wěn)定對植物生理功能起關(guān)鍵作用的酶[13]。Wu等[26]將海蓬子提取的膽堿單加氧酶（CMO）基因轉(zhuǎn)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的GB濃度比野生型煙草提高了9倍左右，當(dāng)向轉(zhuǎn)基因煙草提供5?mmol/L膽堿時(shí)，其GB含量增加了約30倍。在鹽脅迫下，GB能有效地防止轉(zhuǎn)基因植株的膜損傷，轉(zhuǎn)基因煙草在含250～300?mmol/L?NaCl的培養(yǎng)基上生長良好，對提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性是有效的。Luo等[27]等從水稻中分離到一個(gè)OsCOM基因并導(dǎo)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。Northernblot結(jié)果表明，鹽脅迫促進(jìn)了信號蛋白的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因煙草植株表達(dá)過高導(dǎo)致GB含量增加，對鹽脅迫的耐受性也有所提高。免疫印跡分析表明，轉(zhuǎn)基因煙草中存在一種OsCOM功能性蛋白，但在野生型水稻植株中很少積累此蛋白，水稻幼苗中僅產(chǎn)生大量來自O(shè)sCMO的截短蛋白。這說明鹽脅迫下野生型水稻缺乏OsCOM功能性蛋白，可能導(dǎo)致野生型水稻植株中無GB的積累，鹽脅迫下耐鹽性比轉(zhuǎn)基因植物差。

2.2?甜菜堿提高煙草的抗高溫干旱能力?煙草起源于熱帶地區(qū)，喜溫暖濕潤的氣候，對高溫干旱、少雨環(huán)境非常敏感，自身缺乏耐旱調(diào)節(jié)，整個(gè)生育期對水分要求較高[28-30]，干旱會嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量。盧軍等[12]認(rèn)為，在高溫干旱共脅迫下，煙草葉面噴施GB可以顯著提高葉綠素含量、SOD?和?POD?活性，維持較高的脯氨酸含量及較低的丙二醛（?MDA）?含量和質(zhì)膜相對透性，能顯著提高煙草的生物量，對有效減少高溫干旱雙重脅迫對煙草的傷害作用。

煙草葉片噴施適量甜菜堿能顯著提高煙草葉片的保水和耐脫水能力[31-32]。梁太波等[33]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫處理12?d，噴施20?mmol/L外源甜菜堿溶液，煙葉葉綠素含量和可溶性蛋白質(zhì)含量比干旱脅迫對照分別高10.43%和27.01%?？緹煹腟OD和CAT抗氧化酶活性有較大幅度增加，且單獨(dú)噴施甜菜堿溶液比噴施10?mmol/L?脯氨酸溶液或噴施20?mmol/L甜菜堿溶液+10?mmol/L?脯氨酸溶液耐旱脅迫能力都強(qiáng)，說明甜菜堿溶液對煙草葉片的保綠、營養(yǎng)和抗氧化作用方面更為顯著。

轉(zhuǎn)BADH煙草積累甜菜堿，而野生型煙草不積累甜菜堿。45??℃高溫脅迫2?h，轉(zhuǎn)BADH煙草和野生型煙草較30?℃處理下，凈光合速率（Pn）和AQY分別降低了30.8%和38.4%，野生型煙草降低更多，說明轉(zhuǎn)BADH煙草高溫脅迫時(shí)可以維持葉片中較高的Pn和AQY，具有更好的耐高溫性。43??℃高溫下，野生型煙草MDA含量、相對電導(dǎo)率明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草。同時(shí)，甜菜堿可以提高煙草體內(nèi)Ca2+濃度，Ca2+參與植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)并能提高許多植物的耐熱性。1?mmol/L?GB?處理過的煙草在?43?℃處理?2?h?后?鈣調(diào)蛋白（CaM）和熱激蛋白（HSP70）的相對表達(dá)量激增。研究表明，Ca2+參與的高溫脅迫，提高或維持了煙草葉片中SOD、CAT、APX及GR等抗氧化酶活性，O2·-產(chǎn)生速率和H2O2的積累顯著降低，這說明Ca2+增強(qiáng)了煙草葉片高溫脅迫下ROS的清除能力[34]。

2.3?甜菜堿提高煙草的抗寒性?低溫會嚴(yán)重制約大多數(shù)溫帶植物的生長發(fā)育。低溫脅迫抑制植物吸收營養(yǎng)和水分，擾亂細(xì)胞代謝，導(dǎo)致植物功能障礙。植物通過包括信號感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)部響應(yīng)等復(fù)雜的機(jī)制適應(yīng)低溫脅迫[35-37]。

Holmstrm等[38]以甜菜堿積累植物葉片為材料開展相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果表明，在低溫條件下，甘氨酸甜菜堿積累植物葉片的光抑制恢復(fù)能力增強(qiáng)，耐光抑制能力也增強(qiáng)。在轉(zhuǎn)甜菜堿基因的煙草中，甜菜堿的積累與低溫下煙草增加的耐受力有關(guān)，說明低溫環(huán)境下，甜菜堿提高了對煙草葉片光合器官的保護(hù)。

謝會雅等[39]以煙草K326為試驗(yàn)材料，分別用與低溫逆境抗性關(guān)系密切的水楊酸（SA）、甜菜堿（GB）、聚乙二醇（PEG?6000）和?5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）4?種生理活性物質(zhì)對模擬倒春寒低溫下的（6～7?℃，1?000?lx，光照?12?h）煙草葉片進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)處理葉片細(xì)胞滲出液電導(dǎo)率增長幅度降低，可溶性糖、游離脯氨酸含量大幅度增加，過氧化氫酶（CAT）活性下降，MDA含量隨低溫處理時(shí)間的延長而增加。特別是低溫7?d時(shí)，GB對葉綠素含量的保護(hù)相對于PEG6000（0.90?mg/g、72.00%）和5-ALA（0.99?mg/g、78.57%）處理下影響不大，葉綠素鮮重含量和百分含量分別達(dá)0.93?mg/g和73.81%，說明GB對葉綠素具有很好的保護(hù)作用。

王宏偉[40]用K326的轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因的煙草和野生型煙草通過低溫處理研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在低溫5?℃時(shí)葉片開始變黃，野生型煙草癥狀更明顯，葉片萎蔫的程度比轉(zhuǎn)基因煙草嚴(yán)重;轉(zhuǎn)BADH煙草比野生型煙草電解質(zhì)滲漏率低20%。低溫處理5?d后，轉(zhuǎn)BADH煙草與野生型煙草葉片MDA含量相比增加較慢，低于對照的29%。轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量（a、b、a+b）、類胡蘿卜素、表觀量子效率（AQY）和實(shí)際光化學(xué)效率（φPSⅡ）比野生型煙草高，對葉片保綠和抗氧化具有更好的保護(hù)作用。脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[41]。低溫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片中脯氨酸和可溶性糖比野生型煙草葉片中的含量高。葉片提供光合作用，蔗糖是主要光合作用的產(chǎn)物，低溫時(shí)光合作用效率降低，光合產(chǎn)物運(yùn)輸受阻，光合產(chǎn)物累積變少，從而會對光合作用反制，降低光合作用。試驗(yàn)表明，低溫處理下，轉(zhuǎn)基因煙草葉片內(nèi)蔗糖含量也高于野生型煙草。

2.4?甜菜堿提高煙草的抗重金屬能力?重金屬鎘作為植物體內(nèi)非必需的元素，多以硫化物的形式存在于土壤中。研究表明，鎘通過金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白定殖于植物根系細(xì)胞膜或者液泡膜，再進(jìn)入植物體內(nèi)，被植物吸收、累積，造成植株矮小，發(fā)芽緩慢，葉片發(fā)黃皺縮，嚴(yán)重時(shí)葉片出現(xiàn)壞死斑，甚至引起植物死亡[42]。鎘也可以通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康。封鵬雯[43]利用0.2?mmol/L鎘處理轉(zhuǎn)BADH基因煙草和野生型煙草，轉(zhuǎn)BADH煙草比野生型煙草根系的生長發(fā)育、葉片顏色、種子萌發(fā)均有顯著提高。0.5?mmol/L鎘脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉綠素含量顯著高于野生型，說明轉(zhuǎn)BADH煙草中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的甜菜堿發(fā)揮保護(hù)葉片中光合色素和維持較高的光合速率，減緩鎘給煙草葉片帶來的影響。通常情況下，活性氧（ROS）在植物中積累和清除速率基本相等，鎘能造成煙草葉片中（ROS）積累速度遠(yuǎn)大于清除速度，ROS積累過量就會引起煙草基本組織結(jié)構(gòu)和生物大分子紊亂，損害葉片正常功能。對染色葉片中的O2·-和H2O2含量檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草中O2·-和H2O2均低，而抗氧化酶SOD、CAT、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、POD較高，說明轉(zhuǎn)BADH煙草積累的甜菜堿比野生型煙草更加能夠降低鎘脅迫引起的ROS。對煙草鎂元素、鐵元素、銅元素、鋅元素和鈣元素地上部和地下部含量測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中吸收和累積的離子和營養(yǎng)元素比野生型植株更多，能夠保持植株中的離子平衡，減少植株?duì)I養(yǎng)不良。

Islam等[44]研究了外源性脯氨酸和甜菜堿對鎘脅迫下烤煙亮黃-2（BY-2）細(xì)胞生長、脯氨酸和甜菜堿積累、脂質(zhì)過氧化和抗氧化酶活性的保護(hù)作用。用鎘元素?（100?μm?CD）處理發(fā)現(xiàn)，鎘對BY-2細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，脯氨酸和甜菜堿均能明顯減輕這種抑制作用。雖然外源性脯氨酸可以降低鎘脅迫下的脂質(zhì)過氧化，增加SOD和CAT活性，但不降低Cd含量，而施用甜菜堿可降低脂質(zhì)過氧化，增加CAT活性，減少Cd積累。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，外源性脯氨酸和甜菜堿分別增強(qiáng)了BY-2細(xì)胞對脯氨酸和甜菜堿的積累，這些說明脯氨酸和甜菜堿通過不同的機(jī)制使煙草細(xì)胞對鎘脅迫產(chǎn)生耐受性。

3?展望

甜菜堿的主要作用是通過生物體內(nèi)部合成來啟動(dòng)并保護(hù)植物光合系統(tǒng)、酶活、生物膜及基因啟動(dòng)表達(dá)，這些表達(dá)的基因與脅迫響應(yīng)、基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞代謝和植物生長發(fā)育等密切相關(guān)[34]。

李楠等[45]用六棱大麥HVA1基因轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草葉片保水力比對照高1倍左右。外源施用脯氨酸[33]和CaCl2[12]也證明對煙草的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)具有重要作用。近年來，在煙草23中還報(bào)道了Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（SeNHX?1）與BADH基因的共轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，雙基因轉(zhuǎn)基因植株比單基因轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)化野生型對照積累了更多的GB和更高的生物量[46]。這些研究說明煙草在抗逆過程中存在著多種不同的協(xié)同方式。與GB生物合成途徑基因的共同表達(dá)有可能使煙草的抗逆性提高許多倍，這就需要加大努力將涉及多個(gè)基因的不同策略結(jié)合起來。

雖然甜菜堿是通過何種途徑來調(diào)控基因的表達(dá)還不是很清楚，但研究證實(shí)，外源施加甜菜堿或者通過遺傳工程手段在植物體內(nèi)合成甜菜堿均影響煙草基因的表達(dá)，增強(qiáng)煙草對外部的抗逆性是毋庸置疑的。當(dāng)前，關(guān)于煙草的抗逆性都是將煙草作為雙子葉的模式植物之一來研究，而對改良煙草品質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用研究較少且尚未有效地服務(wù)于生產(chǎn)實(shí)踐。因此，今后集中研究煙草在提高、增強(qiáng)和持久抵御多種非生物脅迫耐受性的同時(shí)著重服務(wù)于生產(chǎn)實(shí)踐，積極探索通過外部手段增加煙草產(chǎn)量和改良品質(zhì)。

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