李 鑫 宋尚橋 馬圍圍 鄭 福 曾素先 孫翠翠 嚴(yán) 瑾 黎宗強*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧，530005；2.南寧市江南區(qū)沙井街道辦事處水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，南寧，530033)

Ghrelin是由日本科學(xué)家Kojima等[1]于1999年從大鼠胃組織中提取得到的一種28肽。它是第一個作為生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)[2]的天然內(nèi)源性配體而被發(fā)現(xiàn)，能促進生長激素(growth hormone，GH)的釋放，也是繼生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone，GHRH)[3]和生長抑素(somatostatin，SS)[4]之后，調(diào)節(jié)GH分泌的第3個內(nèi)源性激素[5]。研究表明，ghrelin在小鼠[6]、人[7]、豬[8]、兔[9]、反芻類[10]、禽類[11]、魚類[12]等多種動物中均有分布。Ghrelin是一種腦腸肽，主要分布在動物的消化系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)中[13]。生殖系統(tǒng)中也有g(shù)hrelin陽性細(xì)胞的分布，主要分布在睪丸、附睪、卵巢等組織中，提示ghrein在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。Ghrelin除能調(diào)節(jié)GH分泌外，還參與調(diào)節(jié)攝食與能量代謝、胃腸和心血管功能、記憶睡眠、內(nèi)分泌、生殖等多種生物學(xué)作用[14]。此外，在炎癥、腫瘤等病理過程中也有重要作用。Ghrelin自發(fā)現(xiàn)至今，已引起了廣泛的關(guān)注，成為近年來的研究熱點。盡管ghrelin細(xì)胞在許多物種中的分布定位已有較多文獻報道，然而目前關(guān)于ghrelin細(xì)胞在食蟹猴體內(nèi)的分布定位研究，國內(nèi)外文獻報道較少[15]。

本試驗以成年雄性食蟹猴為試驗動物，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)系統(tǒng)觀察研究ghrelin在食蟹猴生殖系統(tǒng)中的分布定位情況，為進一步研究ghrelin在食蟹猴生殖系統(tǒng)中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究所使用的實驗動物為1只成年雄性食蟹猴，是廣西瑋美生物科技有限公司自繁的F2。食蟹猴(Macacafascicularis)體重4.5 kg，4周歲，身份編號為1007515，除左眼失明外，其他健康狀況良好。由于食蟹猴屬于CITES附錄Ⅱ物種，故動物在出廠、運輸、保管、處死等各個環(huán)節(jié)中均遵守相關(guān)法律法規(guī)。

表1 動物流轉(zhuǎn)檔案登記表

Tab.1 Animal circulation file registration form

1.1.2 主要試劑藥品名稱

速眠新Ⅱ注射液，一抗，SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，多聚賴氨酸，蘇木素染色液，伊紅染液，無水乙醇、二甲苯，甘油，30%過氧化氫，鹽酸，切片石蠟，氯化鈉，多聚甲醛，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，檸檬酸，檸檬酸鈉。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

電子天平，微波爐，PH計，切片機，萬用電爐，水浴鍋，顯微鏡，顯微攝像系統(tǒng)，形態(tài)分析系統(tǒng)，恒溫箱，冰箱，移液槍，石蠟包埋機，病理級顯微載玻片，顯微鏡蓋玻片，中性樹膠。

1.2 方法

1.2.1 組織取材與固定

將食蟹猴按0.3 mg/kg進行速眠新臀部肌肉注射麻醉，分離出頸動脈，剪開一個“V”形小口放血，待血液放掉大約1/3后，用0.9%的生理鹽水從頸動脈進行灌注沖洗，同時將同側(cè)頸靜脈也剪開，待頸靜脈流出的液體呈清亮透明時，再換用4%中性多聚甲醛灌注固定，直至觸摸動物的四肢及腹部內(nèi)臟僵硬為止。然后對灌注后的動物進行組織取材，所采集組織塊大小約為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。將采集到的樣品經(jīng)生理鹽水清洗后，繼續(xù)置于4%中性多聚甲醛溶液里進行固定，固定時間為12—24 h以上。樣品置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制作石蠟切片

流水沖洗入組織中的甲醛溶液、脫水、透明、浸蠟、包埋、修整蠟塊及切片、展片、貼片及烤片。

1.2.3 石蠟切片HE染色步驟

常規(guī)脫蠟至水、蘇木精染色、伊紅染色、脫水、透明、封片與干燥。

1.2.4 免疫組化SABC法染色步驟

(1)常規(guī)脫蠟至水：步驟同HE染色。

(2)熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐中高檔加熱至沸騰后調(diào)至低檔保持10 min，斷電。室溫冷卻后，PBS浸洗2 min×3次。

(3)封閉內(nèi)源性過氧化氫酶：3% H2O2室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS浸洗2 min×3次。

(4)滴加5% BSA封閉液：37 ℃孵育30 min，甩去多余液體，不洗。

(5)滴加一抗：一抗為兔多克隆抗體。用PBS將一抗按1∶1 000稀釋，37 ℃孵育2 h，或4 ℃過夜。PBS浸洗2 min×3次。若一抗在4 ℃冰箱過夜，則需先在37 ℃溫箱復(fù)溫30 min，再進行后續(xù)操作，以免組織脫片。

(6)滴加二抗：二抗為兔IgG。37 ℃孵育1 h，PBS浸洗2 min×3次。

(7)滴加試劑SABC：37 ℃孵育30 min，PBS浸洗5 min×4次。此步驟要增加清洗次數(shù)及時間，以盡量洗凈組織中殘留的試劑，以免影響后續(xù)顯色反應(yīng)。

(8)DAB顯色：將DAB顯色試劑盒中的A、B、C試劑各取1滴，加入1 mL蒸餾水中混勻后滴加至玻片。室溫下顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，一般為3—5 min。蒸餾水洗滌以終止顯色。

(9)復(fù)染：蘇木素復(fù)染1 min，1%鹽酸-乙醇分化液分化2 s，自來水沖洗干凈并返藍。

(10)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

陰性對照組用PBS液代替一抗，其余操作步驟與免疫組化染色組相同。每個組織隨機做3組切片，每組分免疫組化組、陰性對照組兩個比較。此外每個組織另做一張HE染色片，便于更準(zhǔn)確地對實驗結(jié)果進行比較描述。

1.2.5 圖像采集及分析

將不同方法處理后的切片用SmartV 350D顯微攝像系統(tǒng)進行拍照觀察。每個組織樣本取3張切片，每張切片的陽性區(qū)域隨機取3個視野。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：對照組切片染色為陰性，視野內(nèi)無陽性染色，只看到淡染的細(xì)胞核以及少許棕色背景染色。Ghrelin陽性細(xì)胞被染為棕色到棕黑色，細(xì)胞呈集中或散在分布。

2 結(jié)果

2.1 Ghrelin陽性細(xì)胞在睪丸中的分布定位

光鏡下觀察，睪丸組織中曲細(xì)精管管壁為各級生精細(xì)胞，管腔游離面可見大量精子附著(圖1-D黑色箭頭所示)，表明該食蟹猴已達到性成熟。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，陽性顯色在睪丸組織中廣泛分布(圖2-A)。高倍鏡下將圖像進一步放大發(fā)現(xiàn)，在曲細(xì)精管的管壁各層生精上皮中均有g(shù)hrelin陽性產(chǎn)物表達(圖3-B黑色三角所示)，在曲細(xì)精管管腔中呈強陽性表達(圖2-B1)，呈棕黑色染色反應(yīng)。此外，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中也可檢測到較低的ghrelin表達(圖2-B2)。陰性對照組僅見較淡的背景染色，而未見陽性細(xì)胞分布(圖2-C)。

2.2 Ghrelin陽性細(xì)胞在附睪中的分布定位

光鏡下觀察，附睪頭部含有許多睪丸輸出小管，且管腔中含有大量的成熟精子(圖2-D)。免疫組化染色結(jié)果顯示，睪丸輸出小管中可見廣泛的顯色反應(yīng)(圖2-A)。高倍鏡將圖片進一步放大發(fā)現(xiàn)，在睪丸輸出小管的管壁上皮細(xì)胞中(圖2-B1)有g(shù)hrelin陽性產(chǎn)物的表達，但表達量不高，細(xì)胞質(zhì)被染為淡棕黃色。而管腔中則有較高水平的表達，且集中分布在精子尾部中(圖2-B2)，呈棕褐色顯色，其他部位則未見ghrelin陽性產(chǎn)物的表達。陰性對照組僅見較淡的背景染色，而未見陽性細(xì)胞分布(圖2-C)。

2.3 Ghrelin陽性細(xì)胞在輸精管中的分布定位

光鏡下觀察，輸精管的管壁較厚，管腔內(nèi)含有大量的精子(圖2-D)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，輸精管中可見大量的顯色物質(zhì)(圖2-A)。高倍鏡下將圖片進一步放大發(fā)現(xiàn)，在輸精管管壁的黏膜上皮中有微弱的ghrelin產(chǎn)物表達(圖2-B1)，陽性細(xì)胞染色呈淡棕黃色，而管腔中的表達量較高，且集中分布在精子尾部中(圖2-B2)，呈棕褐色顯色反應(yīng)。陰性對照組僅見較淡的背景染色，而未見陽性細(xì)胞分布(圖2-C)。

2.4 Ghrelin在精囊腺中的分布定位

光鏡下觀察，食蟹猴精囊腺的結(jié)締組織被膜深入腺體內(nèi)，將其分割為許多的腺小葉，精囊腺黏膜表面有許多皺襞，腺腔較大(圖2-A)。HE染色發(fā)現(xiàn)精囊腺的腺上皮為假復(fù)層柱狀上皮，腺腔中充滿大量弱堿性被伊紅深染的分泌物(圖2-D)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，精囊腺內(nèi)可見散在顯色反應(yīng)區(qū)域(圖2-A)。高倍鏡下將圖片進一步放大發(fā)現(xiàn)，顯色反應(yīng)只發(fā)生在精囊腺的腺腔之中(圖2-B箭頭所示)，而精囊腺實質(zhì)的染色結(jié)果(圖2-B)與陰性對照組(圖2-C)無明顯差異。可以判定，精囊腺腺腔中的顯色反應(yīng)為背景色。由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)現(xiàn)陽性染色物質(zhì)，表明食蟹猴的精囊腺中無ghrelin陽性細(xì)胞的分布。

圖1 Ghrelin陽性細(xì)胞在睪丸中的分布定位Fig.1 Location of ghrelin positive cells in testicles↑▲陽性表達(Positive expression)；精子附著(Sperm attached) A.IHC組 The IHC group(×100)；B.曲細(xì)精管 Song of seminiferous tubule(×400)；C.對照組(×400)The control group；D.HE組 The HE group(×400)

圖2 Ghrelin陽性細(xì)胞在附睪中的分布定位Fig.2 Location of ghrelin positive cells in epididymis陽性表達(Positive expression) A.IHC組 The IHC group(×100)；B.睪丸輸出小管 Testicular output tubule(×400)；C.對照組(×400)The control group；D.HE組 The HE group(×400)

圖3 Ghrelin陽性細(xì)胞在輸精管中的分布定位Fig.3 Location of ghrelin positive cells in the vas deferens顯色物質(zhì)(Color material)；↓↑陽性表達(Positive expression) A.IHC組 The IHC group(×100)；B.輸精管 Vas deferens(×400)；C.對照組(×400)The control group；D.HE組 The HE group(×400)

圖4 Ghrelin在精囊腺中的分布定位Fig.4 Location of ghrelin distribution in seminal vesicles疑似為陽性表達的背景色(Suspected background color of positive expression) A.IHC組 The IHC group(×100)；B.精囊腺 Seminal vesicle gland(×400)；C.對照組(×400)The control group；D.HE組 The HE group(×400)

3 討論

早期研究發(fā)現(xiàn)，在人和大鼠睪丸的成熟間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有g(shù)hrelin的表達，在人睪丸支持細(xì)胞中g(shù)hrelin表達水平較低[16]。Tena-Sempere等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在幼齡大鼠和青春期前大鼠的睪丸組織中g(shù)hrelin的表達水平較弱，而在性成熟大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達水平較高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，去除大鼠睪丸組織中的間質(zhì)細(xì)胞后，大鼠睪丸中沒有g(shù)hrelin陽性產(chǎn)物的表達，而恢復(fù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞后又可重新檢測到ghrelin陽性細(xì)胞?？梢姡笫蟛G丸組織中的ghrelin陽性產(chǎn)物可能主要來源于睪丸間質(zhì)細(xì)胞。Gaytan等[18]檢測到在人和大鼠的睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及輸精管中均有g(shù)hrelin蛋白的表達，在生殖細(xì)胞的早期生精細(xì)胞中有分布，精子細(xì)胞則沒有。王艷梅等[19]在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin主要表達在正常小鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。而經(jīng)過X線照射后，小鼠睪丸的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及早期的精子細(xì)胞中均有g(shù)hrlin的表達，并推測ghrelin這種表達方式的改變可能參與小鼠輻射急性損傷后的修復(fù)過程。徐金霞[20]研究了小鼠生后不同發(fā)育階段睪丸組織ghrelin的表達，結(jié)果顯示從1到16周齡小鼠的睪丸組織中均有g(shù)hrelin的表達，且這種表達具有階段性和選擇性的特點。Ghrelin在小鼠睪丸中主要分布于被膜、睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞中；此外，在睪丸曲細(xì)精管、生精細(xì)胞、精子細(xì)胞、管腔中也有不同程度、不同階段的表達。

本研究表明，在食蟹猴睪丸組織中，ghrelin廣泛分布于曲細(xì)精管的各層生精細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，附睪及輸精管中也有分布，這些研究結(jié)果與前期研究結(jié)果相一致。而在食蟹猴精囊腺中未發(fā)現(xiàn)有g(shù)hrelin陽性細(xì)胞的分布，由于ghrelin在副性腺中的分布研究相關(guān)文獻報道較少，故無法與其他動物進行比較分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin在睪丸組織中有較高劑量的表達，提示ghrelin可能參與生精上皮的發(fā)育及促進精子的發(fā)生。附睪及輸精管的實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達量較低，但管腔中均呈高劑量表達，且集中分布在精子尾部中。推測，睪丸、附睪及輸精管中的ghrelin陽性細(xì)胞釋放ghrelin進入管腔，并附著到精子上，進而參與精子的成熟?？梢?，ghrelin在雄性動物的生殖系統(tǒng)中可參與調(diào)節(jié)精子的生成與成熟過程，并由此發(fā)揮調(diào)控動物生殖生理的重要作用。然而，動物的生殖調(diào)控機制是多方面的，有關(guān)ghrelin對生殖機理的調(diào)控機制還有待進一步探討研究。

4 結(jié)論

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，ghrelin陽性細(xì)胞在食蟹猴的生殖系統(tǒng)中有分布。Ghrelin免疫陽性細(xì)胞被染為棕色到棕黑色，主要分布于睪丸、附睪及輸精管中，精囊腺中無ghrelin陽性細(xì)胞分布。Ghrelin陽性細(xì)胞在組織中多呈散在分布。細(xì)胞大小不一、形態(tài)各異，多呈圓形、卵圓形、錐體形、長柱形及其他不規(guī)則形。