劉竟雅 侯曉昱 吳金燕 姜 楠 馮 濤 薛 原

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

貉(Nyctereutesprocyonoides)是一種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，目前它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)在毛皮的用途上，除了能夠制成輕便、耐寒、美觀的衣物以外。還能制成書(shū)寫(xiě)刷和化妝刷一類(lèi)的產(chǎn)品。此外，根據(jù)近期研究發(fā)現(xiàn)貉的膽汁有望代替熊膽入藥[1]。

在貉的各種疾病中，細(xì)菌病占了很大比例，大腸桿菌(Escherichiacoli)病常對(duì)腸道和神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，四環(huán)素被廣泛用作治療和預(yù)防貉細(xì)菌病的廣譜抗生素，它作為一種選擇機(jī)制[2]，讓具有四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌存活下來(lái)。這逐漸增加了大腸桿菌抗性基因頻率，并改變了種群動(dòng)態(tài)。同時(shí)擁有抗性基因的大腸桿菌不斷排入到生態(tài)系統(tǒng)，抗性基因在種群中不斷轉(zhuǎn)移，使得該病治療的難度很大。不同的四環(huán)素類(lèi)藥物的使用，令不同地區(qū)、不同農(nóng)場(chǎng)的大腸桿菌耐藥性存在一些差異[3]

四環(huán)素藥物作為一種廣譜抗菌藥，效果好，毒性低，廉價(jià)易得，因此被廣泛用于人畜疾病預(yù)防和治療中。然而，其長(zhǎng)期的過(guò)度使用也導(dǎo)致其抗性菌株的出現(xiàn)和增長(zhǎng)。到目前為止，世界上許多發(fā)達(dá)國(guó)家，仍然把含有大量廣譜和高效的四環(huán)素抗生素的生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于畜牧業(yè)，同時(shí)四環(huán)素類(lèi)藥物在治療人和動(dòng)物的細(xì)菌感染等方面已經(jīng)使用了很長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致近幾年來(lái)耐藥菌株不斷出現(xiàn)在我們的生態(tài)環(huán)境中[4]。

在這項(xiàng)研究中，我們從不同地區(qū)不同飼養(yǎng)場(chǎng)健康貉體內(nèi)分離大腸桿菌，并測(cè)試其四環(huán)素耐藥基因，為將來(lái)四環(huán)素的臨床使用提供理論依據(jù)，據(jù)報(bào)道，tetA、tetB、tetC和tetM是大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的主要耐藥基因[5]。在這個(gè)結(jié)論的指導(dǎo)下，我們對(duì)它進(jìn)行了驗(yàn)證和探索，得出兩者之間的關(guān)系，對(duì)于今后科學(xué)、有效使用四環(huán)素具有很大的意義，還可以減少貉養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失，并指導(dǎo)合理使用藥物。

1 材料

1.1 菌株

試驗(yàn)用大腸桿菌56株，分離自黑龍江省和吉林省貉養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑

10×Buffer、Dntp、Taq酶、DL-2000 Marker、6×Loading Buffer，均由TaKaRa公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PCR擴(kuò)增模板的制備

將56株貉源大腸桿菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落置于LB肉湯中，37 ℃搖床培育3 h獲得一定濃度的菌液。

2.2 四環(huán)素基因的檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]，由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成TetA、TetB、TetC、TetD、TetE、TetM這6種四環(huán)素基因的引物，其序列見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂凝膠中電泳。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀成像分析。

表1 引物序列信息

Tab.1 Primer sequences information

3 結(jié)果

電泳出樣獲得了與預(yù)期長(zhǎng)度一致的目標(biāo)條帶，結(jié)果顯示本批貉大腸桿菌樣品中，四環(huán)素耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetM均有檢出，其中以tetM檢出率最高為82.14%，tetA、tetB、tetC的檢出率依次為16.07%、28.57%、5.35%，tetE檢出率為零。

圖1 tetA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplified results of tetA gene 注：M：DNA marker；2—6：tetA耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 Note：M：DNA marker.2-6：PCR products of tetA gene

圖2 tetB的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplified results of tetB genes 注：M：DNA marker；1—6：tetB耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 Note：M：DNA marker.1-6：PCR products of tetB gene

圖3 tetC的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplified results of tetC genes 注：M：DNA marker；1—3：tetC耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 Note：M：DNA marker.1-3：PCR products of tetC gene

圖4 tetM的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplified results of tetM genes 注：M：DNA marker；1—6：tetM耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 Note：M：DNA marker.1-6：PCR products of tetM gene

4 討論

細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)與其耐藥基因的存在及數(shù)量密切相關(guān)。根據(jù)先前黑龍江省和吉林省貉源大腸桿菌耐藥性的檢測(cè)，可以得知貉源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出較高的耐藥性，其耐藥率超過(guò)60%[8]。因此，基于該結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在分子水平檢測(cè)了大腸桿菌四環(huán)素抗性基因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四環(huán)素耐藥性的確與四環(huán)素耐藥基因的存在密切相關(guān)，尤其是tetM。

一般認(rèn)為，細(xì)菌對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制包括4種：外排泵機(jī)制，核糖體保護(hù)機(jī)制，鈍化酶機(jī)制，核糖體靶位修飾機(jī)制[9]。Tet基因廣泛存在于人源、動(dòng)物源、共生菌和和環(huán)境條件致病菌的不同菌種[9]。大腸桿菌的耐藥性主要基于主動(dòng)外排機(jī)制，也伴有其他耐藥機(jī)制，例如tetM基因則是本實(shí)驗(yàn)中核糖體保護(hù)機(jī)制(四環(huán)素類(lèi)藥物作用的主要作用機(jī)制是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，而許多對(duì)四環(huán)素耐藥的微生物能夠合成一種核蛋白體保護(hù)蛋白[9]。從而保證細(xì)菌中蛋白質(zhì)的正常合成，臨床表現(xiàn)為耐藥性。而tetM基因正是這種蛋白的一種編碼基因)。被研究較多的主動(dòng)外排基因主要是tetA、tetB、tetC等[10]。其中，tetA、tetB、tetC3種基因在本實(shí)驗(yàn)中均有較高的檢出率。但本實(shí)驗(yàn)貉源大腸桿菌中以攜帶tetM基因?yàn)橹?，檢出率高達(dá)82.14%。在表明不同來(lái)源大腸桿菌中各種抗性基因攜帶狀態(tài)有較大的差異。此外，貉的四環(huán)素耐藥性可能由tetM基因支配。

研究表明，禽大腸桿菌中，tetA、tetB、tetC、tetM基因也廣泛存在[10]，與本實(shí)驗(yàn)大腸桿菌中抗性基因的攜帶狀態(tài)一致。此外，在相關(guān)的魚(yú)類(lèi)和家禽育種的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，環(huán)境標(biāo)本中tetM基因檢出率極高，幾乎接近100%。

tetM基因在對(duì)四環(huán)素耐藥的革蘭氏陽(yáng)性菌中比較常見(jiàn)。而革蘭氏陰性菌中tetA和tetB較多[11-12](一般認(rèn)為主動(dòng)外排機(jī)制和核糖體保護(hù)機(jī)制為四環(huán)素產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制，其中革蘭氏陰性菌主要是主動(dòng)外排作用，革蘭氏陽(yáng)性菌以核糖體保護(hù)機(jī)制為主[13])。2004年Bryan等[14]從雞和豬體內(nèi)分離的大腸桿菌中克隆得到了tetM基因。而食物源標(biāo)本的tetM檢出率中，魚(yú)類(lèi)高于豬肉類(lèi)，豬肉類(lèi)高于禽類(lèi)[14]。這也表明了tetM基因宿主具有多種類(lèi)型和廣泛的范圍。過(guò)往研究認(rèn)為，核糖體保護(hù)類(lèi)抗性基因具有較強(qiáng)的遷移轉(zhuǎn)化能力，能和可移動(dòng)元件結(jié)合，從而在不同的微生物之間傳播[15]。由于其廣泛的的宿主菌群范圍和強(qiáng)大的遷移轉(zhuǎn)化能力，tetM基因可以通過(guò)宿主細(xì)菌為食物鏈和畜群中輕松運(yùn)輸。含有tetM的基因可以殘存在飼料和食物中，從而進(jìn)入動(dòng)物體和人體，因此含有tetM抗性基因的菌群廣泛存在于動(dòng)物體和人體中?？梢酝茰y(cè)，吉林省和黑龍江省健康貉中大腸桿菌中檢出tetM最高的原因可能是其飼料中存在著含有tetM的微生物。此外，tetM基因能夠通轉(zhuǎn)導(dǎo)接合作用在某些病原菌的群體中轉(zhuǎn)移。該機(jī)制的研究對(duì)于防止病原菌抗藥性的出現(xiàn)以及擴(kuò)散具有重要的意義。

同時(shí)本試驗(yàn)檢測(cè)出的tetA和tetB基因主要通過(guò)主動(dòng)外排機(jī)制介導(dǎo)四環(huán)素的抗性[10]。根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)，在不同地域、物種等檢測(cè)出的主動(dòng)外排基因中，主要以tetA和tetB基因檢出最多，尤其是tetB，并且多重耐藥菌株中tetB基因的檢出率更高。這表明tetB基因在介導(dǎo)多重耐藥有重要的作用[10]，也符合本實(shí)驗(yàn)中健康貉大腸桿菌四環(huán)素多重耐藥的事實(shí)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量的報(bào)道顯示，tetA、tetB等的遺傳環(huán)境中含有許多可自由移動(dòng)的轉(zhuǎn)座子[11]。抗性基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子與其他的一些基因連接。而這些基因可以通過(guò)質(zhì)粒接合而傳遞，在該過(guò)程中傳遞抗藥性。可移動(dòng)元件質(zhì)粒、整合子[9]、轉(zhuǎn)座子等有效的介導(dǎo)了耐藥基因的存在和轉(zhuǎn)移。因此這些流動(dòng)成分的研究對(duì)于四環(huán)素乃至很多其他抗生素有著深遠(yuǎn)意義，此外，對(duì)中國(guó)大量細(xì)菌耐藥基因的研究也僅止步于基因表型的測(cè)定，對(duì)于轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)成分的研究和報(bào)道很少。在這方面仍有很多未知的知識(shí)需要探索。一旦實(shí)現(xiàn)了新的突破，預(yù)防耐藥性的出現(xiàn)和預(yù)防轉(zhuǎn)移就可以發(fā)揮重要的作用，降低臨床用藥治療和預(yù)防的難度。

貉作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其毛皮和膽汁均有著十分廣泛的用途。為了更好地發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)，及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查非常重要。目前為止，最有效的方法仍然是減少抗生素的使用以避免耐藥的出現(xiàn)。另外飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生檢查也應(yīng)該符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，避免由于飼料及畜舍的衛(wèi)生問(wèn)題而導(dǎo)致耐藥菌群的擴(kuò)散。