朱珊麗，丁寧，項(xiàng)丹，董海艷，薛向陽(yáng)，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035）

2019年末開(kāi)始，我國(guó)暴發(fā)了新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染肺炎疫情，形勢(shì)嚴(yán)峻。SARS-CoV-2屬β冠狀病毒屬，其長(zhǎng)約30 kb的基因組中僅10 kb為編碼區(qū)，編碼結(jié)構(gòu)蛋白與輔助蛋白，其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白分別為：刺突蛋白（S protein）、膜蛋白（M protein）、包膜蛋白（E protein）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid）[1-3]。其中，S蛋白可被宿主蛋白酶裂解為S1與S2兩個(gè)亞單位，其中S1亞單位位于包膜刺突的頂端，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，是決定病毒入侵易感細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白；而S2亞單位則形成刺突的莖部，介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合，促使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。因此，SARSCoV-2的S刺突蛋白在病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和侵入過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而通過(guò)阻斷病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和穿入是特異性預(yù)防SARS-CoV-2感染的重要途徑。本研究擬利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析SARSCoV-2 S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及可能的B細(xì)胞表位，為研究該蛋白的功能及疫苗開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512）獲得SARS-CoV-2 S區(qū)域的核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列（NC_045512.2）。

1.2 SARS-CoV-2 S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用EXPASY服務(wù)器（https://www.expasy.org/resources）上的SOPMA、GOR等方法分析預(yù)測(cè)S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。1.3 SARS-CoV-2 S蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 采用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)分析S蛋白的跨膜區(qū)。

1.4 SARS-CoV-2 S蛋白親水性、表面可及性、抗原性預(yù)測(cè) 采用Kyte-Doolittle親水性參數(shù)[4]、Emini表面可及性參數(shù)[5]、Jameson-Wolf抗原性指數(shù)（antigenicity index，AI）[6]等進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 綜合分析 對(duì)上述預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，兼顧各預(yù)測(cè)參數(shù)推測(cè)SARS-CoV-2 S蛋白可能的B細(xì)胞表位，并用吳玉章等[7]建立的AI計(jì)算方法，綜合評(píng)判SARS-CoV-2 S蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。

2 結(jié)果

2.1 S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸有1 273個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為140 kDa。分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的SOPMA、GOR方法預(yù)測(cè)S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2種方法對(duì)S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致性較高，均提示S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域以無(wú)規(guī)卷曲為主，少見(jiàn)β-轉(zhuǎn)角，且無(wú)規(guī)卷曲主要位于其氨基酸的19～35、69～90、145～168、205～219、228～236、247～262、379～393、437～451、461～506、515～689、695～718、789～814、1 105～1 119、1 133～1 145區(qū)段（見(jiàn)圖1）。

2.2 S蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 經(jīng)TMHMM預(yù)測(cè)分析，SARSCoV-2 S蛋白為一單次跨膜蛋白，N端大部分氨基酸位于膜外，C末端位于膜內(nèi)（見(jiàn)圖2）。這一預(yù)測(cè)結(jié)果與SARS-CoV S蛋白的跨膜區(qū)一致，即S蛋白N端氨基酸組成刺突頂部與人肺泡細(xì)胞膜表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶II（angiotensin converting enzyme II，ACE2）受體結(jié)合，C端除融合肽、HR區(qū)段外，末端約60個(gè)氨基酸組成跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)。

圖2 TMHMM預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 S蛋白的跨膜區(qū)

圖1 SARS-CoV-2 S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 S蛋白的親水性、表面可及性、抗原性參數(shù)預(yù)測(cè) 應(yīng)用不同的方法預(yù)測(cè)，SARS-CoV-2 S蛋白B細(xì)胞抗原表位的數(shù)量及抗原表位可能出現(xiàn)的肽段均不同，但其中71～84、144～168、352～361、404～428、525～539、565～582、676～689、772～779、807～818區(qū)段則基本一致（見(jiàn)圖3）。

2.4 SARS-CoV-2 S蛋白表位的綜合分析 綜合以上預(yù)測(cè)結(jié)果，并根據(jù)吳玉章等[7]建立的AI計(jì)算方法，計(jì)算SARS-CoV-2 S蛋白可能的B細(xì)胞表位區(qū)段平均AI。結(jié)果顯示，S蛋白的354～360、437～445、454～471、527～537、567～582、678～685、772～779和806～818區(qū)段AI相對(duì)較高，這些區(qū)域可能是SARS-CoV-2 S蛋白潛在的B細(xì)胞表位（見(jiàn)表1）。

3 討論

冠狀病毒基因組編碼的S刺突蛋白是病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白，也是介導(dǎo)冠狀病毒感染和入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因子。有研究報(bào)道SARS-CoV S蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，故S蛋白是疫苗、治療性抗體的研制及臨床診斷的主要靶蛋白[8]。

圖3 多種不同參數(shù)對(duì)S蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果

表1 SARS-CoV-2 S蛋白的B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域的平均AI

然而，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)SARS-CoV全長(zhǎng)S蛋白作為疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體IgG，在降低肺部病毒滴度的同時(shí)還可產(chǎn)生病理性免疫反應(yīng)，即促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-8、MCP-1的產(chǎn)生和炎性巨噬細(xì)胞在肺部聚集引起急性肺損傷[9]。另有研究報(bào)道，接種全長(zhǎng)S蛋白疫苗后接受SARS-CoV攻擊，機(jī)體中病毒的感染量更高，即產(chǎn)生了抗體依賴(lài)的增強(qiáng)作用（antibody-dependent enhancement，ADE），并可引起受試動(dòng)物肝損傷[10-12]。故推測(cè)全長(zhǎng)S蛋白并不是疫苗研發(fā)的最佳選擇，其安全性和保護(hù)性能需進(jìn)一步考慮。且S蛋白的高度糖基化可以使其結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，通過(guò)表位覆蓋逃避機(jī)體免疫力[13]。故多種因素導(dǎo)致迄今尚無(wú)成功的SARS-CoV疫苗上市[14]。篩選S蛋白中的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位作為疫苗設(shè)計(jì)、免疫治療和臨床診斷的靶點(diǎn)，可避免全長(zhǎng)S蛋白的局限性和副作用。

全基因組測(cè)序結(jié)果提示，SARS-CoV-2與SARSCoV S蛋白的氨基酸序列同源性有76.47%[3，15]，說(shuō)明兩者在結(jié)構(gòu)和功能有一定的相似度，如兩者均利用高度糖基化的三聚體S蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞；酶解后的S1亞單位結(jié)合到宿主細(xì)胞ACE2蛋白受體上，S2亞單位形成高度穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞膜融合[16-17]。相較于SARS-CoV，SARS-CoV-2最顯著的變化是具有S1/S2蛋白酶切割位點(diǎn)“RRAR”氨基酸序列，而SARS-CoV中該酶切位點(diǎn)僅具單個(gè)精氨酸[18]，且SARS-CoV-2與ACE2的親和力遠(yuǎn)高于SARS-CoV[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，盡管兩病毒S刺突蛋白的受體結(jié)合區(qū)（receptor binding domain，RBD）結(jié)構(gòu)高度相似，但針對(duì)SARS-CoV RBD的抗體對(duì)SARS-CoV-2并無(wú)明顯的結(jié)合反應(yīng)[19]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，筆者推測(cè)如同SARS-CoV，SARS-CoV-2 S蛋白全長(zhǎng)作為疫苗研制靶點(diǎn)具有局限性，即可引起病理性免疫反應(yīng)，雖然目前尚無(wú)研究證實(shí)這一點(diǎn)；同時(shí)SARS-CoV-2 S蛋白又具備獨(dú)特的表位區(qū)，故S蛋白中B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、篩選及鑒定顯得尤為重要。根據(jù)B細(xì)胞表位的內(nèi)在特征，先采用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，再合成相應(yīng)多肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，不失為一種省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)的方法。本研究聯(lián)合使用Kyte-Doolittle的親水性方案、Emini的蛋白質(zhì)表面可能性方案、Jameson-Wolf的AI方案和吳玉章AI預(yù)測(cè)法，輔以跨膜區(qū)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 S蛋白的B細(xì)胞表位。推測(cè)其可能的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位主要集中于S蛋白的中間位置，如354～360、437～445、454～471、527～537、567～582、678～685、772～779和806～818位氨基酸或其附近。進(jìn)一步分析，437～445和454～471位氨基酸位于SARS-CoV-2 S蛋白的RBD，若經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些表位的存在，則可以此為基礎(chǔ)，開(kāi)展SARSCoV-2預(yù)防性疫苗和藥物的研究。上述幾個(gè)區(qū)域僅僅是SARS-CoV-2 S蛋白中B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)段，并不包括所有的抗原表位，如73～84位氨基酸也有可能是B細(xì)胞表位。

本研究?jī)H是對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白候選B細(xì)胞表位進(jìn)行初步篩選，但最終必須用實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確認(rèn)。