汪雪睿 黃保嘉 李 想， 王 碩 程 代，*

（1 天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 天津 300457 2 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津 300071）

鎘是一種廣泛分布于環(huán)境中的重金屬元素，會通過自然界的富集作用逐漸以食源性途徑進入人體[1-2]。鎘污染引起的“痛痛病”爆發(fā)后，鎘的生物毒性受到世界廣泛關(guān)注。世衛(wèi)組織在食品污染毒性報告中指出，鎘是排名第三的食品污染物，僅次于黃曲霉毒素和砷[3]。國際癌癥研究委員會（IARC）也將鎘列為IA 類致癌物[4]。研究表明，人體中的鎘主要在肺和消化道中被吸收，生物半衰期長達10～40 年，吸收后的鎘會主要蓄積在生物體的肝臟和腎臟部位，從而引發(fā)臟器功能損傷、生殖系統(tǒng)損傷、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和癌癥等疾病[5]。鎘的毒性主要歸結(jié)于其對機體氧化還原體系及離子穩(wěn)態(tài)的破壞，鎘會增強細胞膜結(jié)構(gòu)上發(fā)生的脂質(zhì)過氧化作用，對機體產(chǎn)生氧化脅迫損傷細胞結(jié)構(gòu)，并抑制機體內(nèi)過氧化物酶的活性，進一步加重機體氧化損傷[6]。

茶多酚（Tea polyphenols，TP），是從茶葉中提取出的多羥基酚類化合物[7-8]。大量研究表明，茶多酚具有抗氧化，免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，抗菌，預(yù)防動脈硬化等多種生物保健功能[8-10]。茶多酚可直接作用于自由基或與自由基相關(guān)的酶，與誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化作用的金屬離子絡(luò)合，從而發(fā)揮生物活性[8]。路宏朝等[11]研究表明，茶多酚可顯著降低酒精性肝損傷的大鼠肝臟中ROS 濃度。馬蘭萍等[12]研究表明茶多酚可以抑制紅細胞膜上發(fā)生的脂質(zhì)過氧化，防止紅細胞溶血。

本文采用腹腔注射CdCl2溶液的方式建立急性染鎘小鼠模型，通過小鼠血紅細胞脆性和形態(tài)學(xué)觀察以及肝臟和血液中Cd 元素含量檢測，結(jié)合肝臟氧化應(yīng)激水平的變化和肝臟病理學(xué)觀察，評估鎘對小鼠肝臟及血液結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及茶多酚對急性鎘暴露引起的肝臟和血液毒性的預(yù)防效果。對于后續(xù)利用茶多酚等植物多酚提取物，以食源性方式預(yù)防和改善鎘中毒具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32 只8 周齡雄性昆明小鼠，體重30～35 g。實驗用批準(zhǔn)號為SCXK（2007-2004），由北京斯貝福生物有限公司提供。

1.2 材料與試劑

茶多酚（純度98%）、肝素鈉、PBS 緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；CdCl2（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；結(jié)晶紫（純度98%），天津市百世化工有限公司；戊二醛（純度50%），歐博特化工貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗儀器

電子天平，奧豪斯公司；pH 計，梅特勒托利多公司；微波消解儀，培安；Thermo 991 超低溫冰箱、MK-3 型酶標(biāo)儀、SP131320-33 磁力攪拌器，賽默飛世爾科技；MX-E 混勻器，賽洛捷克；紫外可見分光光度計，德國Eppendorf 公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜，德國賽默飛世爾公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 實驗動物分組 32 只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機分為4 組，分別為空白對照組、染鎘模型組、茶多酚保護組和茶多酚對照組，每組8只，自由采食和飲水，飼養(yǎng)5 d。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，相對濕度（45±3）%，12 h 光照/黑暗連續(xù)循環(huán)。

1.4.2 給藥劑量與方法 按照上述分組，以腹腔注射的形式給藥。空白對照組：0.9%NaCl；Cd：單次腹腔注射CdCl2（0.5 mg/mL）于小鼠；Cd+TP 組：單次腹腔注射CdCl2（0.5 mg/mL）于小鼠，后續(xù)用TP（100 mg/kg）腹腔注射5 d 進行干預(yù)；TP 組：連續(xù)5 d 小鼠腹腔注射茶多酚（100 mg/kg）。

腹腔注射結(jié)束后，各組小鼠禁食（飲水自由）24 h，麻醉小鼠，由股動脈取血，解剖摘取肝臟，所有樣品及時置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 生化指標(biāo)測定

1.4.3.1 紅細胞的滲透脆性曲線 通過不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉（NaCl）溶液測定小鼠紅細胞滲透脆性，在540 nm 波長處測量上清的OD 值?？瞻讓φ兆魅苎?00%，繪制紅細胞滲透脆性曲線。

1.4.3.2 紅細胞的形態(tài)學(xué)觀察 用0.5%結(jié)晶紫對各組紅細胞的海恩茲小體進行檢測，將細胞固定在玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察紅細胞形態(tài)（放大100 倍）。

用1%戊二醛固定各組紅細胞懸液，乙醇分級脫水。室溫下自然干燥，制片后樣品噴涂金屬膜，在掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察紅細胞形態(tài)。

1.4.3.3 血液及肝臟中鎘含量測定 分別稱取0.1 g 全血和0.2 g 剪碎的小鼠肝臟進行微波消解。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測樣品溶液，得到肝臟及血液中的鎘含量（mg/kg）。

1.4.3.4 肝臟組織生理生化指標(biāo)的測定 取小鼠肝臟制成10%組織勻漿液，采用相關(guān)試劑盒測定勻漿液中丙二醛（MDA）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.4.3.5 小鼠血清內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOP）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）的活性測定 采用試劑盒方法并參考相關(guān)文獻測定[13]。酶活性以每分鐘每毫升血清催化產(chǎn)生的丙酮酸表示，單位為nmol/（min·mL）。

1.4.3.6 肝臟組織病理學(xué)觀察 肝臟組織用福爾馬林溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度5 μm），經(jīng)二甲苯脫蠟-乙醇復(fù)水-細胞核蘇木精染色-氨水返藍-伊紅染液細胞質(zhì)染色-酒精脫水并干燥-樹膠封固的步驟后，在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)狀況。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗數(shù)據(jù)均以Mean±SD 表示，運用SPSS Statistics 18.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。P＜0.05 為差異具有顯著性，P＜0.01 為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對急性鎘暴露小鼠紅細胞滲透脆性的影響

紅細胞滲透脆性與細胞的比表面積和形變能力以及細胞內(nèi)氧自由基數(shù)目及各種酶活有關(guān)。由圖1 可知，當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減小時，尤其當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.4%～0.5%范圍之間，紅細胞溶血率發(fā)生突變。染鎘模型組較空白組脆性變大，溶血率升高，表明紅細胞損傷嚴(yán)重。茶多酚保護組較染鎘模型組溶血率降低，脆性減小，表明茶多酚減弱了由鎘誘導(dǎo)紅細胞脆性增大導(dǎo)致的破裂損傷，茶多酚對照組紅細胞溶血率較空白組而言沒有顯著性改變。

2.2 茶多酚對急性鎘暴露小鼠紅細胞形態(tài)的影響

由圖2 可得，空白組（A）與茶多酚對照組（D）的紅細胞形態(tài)正常、無損傷，呈現(xiàn)正常的凹陷形圓盤狀。而染鎘模型組（B）可以觀察到紅細胞膜表面出現(xiàn)黑色小點，即海恩茲小體（圖中紅色圓圈標(biāo)記），說明鎘暴露下使紅細胞產(chǎn)生了氧化損傷，血紅蛋白變性后聚集；掃描電子顯微鏡顯示大量紅細胞失去正常形狀，表面有針狀突起，變得不規(guī)則。茶多酚保護組（C）則較損傷組（B）海恩茲小體和棘形紅細胞數(shù)量明顯減少，表明茶多酚可以減輕鎘誘導(dǎo)的紅細胞損傷情況。

圖1 茶多酚對急性鎘暴露下小鼠紅細胞滲透脆性的影響Fig.1 Effect of tea polyphenols on erythrocyte osmotic fragility in mice exposed to acute cadmium

2.3 茶多酚對急性鎘暴露小鼠血液及肝臟中鎘含量的影響

由圖3 可得，染鎘模型組同空白對照組相比，血液和肝臟中鎘含量顯著升高，表明鎘在血液循環(huán)的影響下向其它組織傳遞。與染鎘模型組相比較，茶多酚保護組的鎘含量顯著降低，說明茶多酚能減少鎘在血液及肝臟中的積累。兩個對照組結(jié)果未顯現(xiàn)出明顯的差異。

2.4 茶多酚對急性鎘暴露小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

當(dāng)肝臟發(fā)生病變時，AST 和ALT 會釋放入血，血清中的AST 和ALT 活性會隨著肝臟損傷加重而升高。故血清中的AST 和ALT 酶活可作為檢測肝功能的指標(biāo)。由圖4 可知，染鎘模型組的AST及ALT 活性較空白對照組有極明顯的升高趨勢，表明肝臟細胞在鎘暴露下有損傷甚至病變情況產(chǎn)生。茶多酚保護組相比染鎘模型組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性降低了15.3%；谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性降低了12.1%，說明茶多酚能夠減輕鎘對小鼠肝臟的損傷作用。兩個對照組AST 及ALT 活性基本無差異，表示茶多酚對肝臟無明顯傷害。

圖3 茶多酚對急性鎘暴露小鼠血液及肝臟中鎘含量的影響Fig.3 Effect of tea polyphenols on cadmium content in blood and liver of mice exposed to acute cadmium

圖4 茶多酚對急性鎘暴露小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（a）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（b）活性的影響Fig.4 Effect of tea polyphenols on the activities of aspartate aminotransferase（a）and alanine aminotransferase（b）in serum of mice exposed to acute cadmium

2.5 茶多酚對急性鎘暴露小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

超氧化物歧化酶（SOD）具有清除機體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基的功能。通過檢測器官SOD 水平，可以評價器官功能以及其所受的氧化損傷程度等指標(biāo)。過氧化氫酶（CAT）是機體內(nèi)氧化還原體系的重要組成酶，廣泛存在于各個組織器官中，特別在肝臟中的濃度較高，負責(zé)及時分解由機體代謝產(chǎn)生的H2O2，保證機體免受氧化損傷。當(dāng)器官內(nèi)部過氧化氫酶較低時，表明組織對機體內(nèi)部氧化損傷的應(yīng)對能力較弱。結(jié)果顯示，染鎘模型組較空白對照組的CAT 及SOD 活力下降，說明鎘顯著減弱小鼠肝臟的抗氧化能力。茶多酚保護組較損傷組CAT 活性顯著升高49.5%；SOD 活性升高16.2%，表明茶多酚能降低鎘引起的酶活性減弱，并且能在一定程度上提高肝的抗氧化性。

在小鼠肝臟組織中，丙二醛（MDA）是由自由基（ROS）與脂質(zhì)發(fā)生一系列氧化反應(yīng)產(chǎn)生的。因此，可根據(jù)組織中丙二醛含量推測肝臟過氧化程度。由圖5 可知，急性染鎘后肝臟中丙二醛的含量顯著高于空白對照組，這表明鎘導(dǎo)致肝細胞損傷，促進脂質(zhì)過氧化。茶多酚保護組較染鎘組丙二醛含量下降28.0%，說明茶多酚對鎘引起的過氧化反應(yīng)具有較好的保護作用。

圖5 茶多酚對急性鎘暴露小鼠肝臟SOD 活性（a）、CAT 活性（b）和MDA 含量（c）的影響Fig.5 Effect of tea polyphenols on SOD activity（a），CAT activity（b）and MDA content（c）in mice exposed to acute cadmium

2.6 茶多酚對急性鎘暴露小鼠肝臟組織的影響

由圖6 可見，空白對照組（a）中有較為完整的肝小葉組織，包含正常狀態(tài)的中央靜脈（CV）、肝血竇（黑色箭頭）和圍繞靜脈分布、排列有序的肝索細胞（E）；而鎘暴露組（b）中，肝臟組織有較為明顯的損傷情況，表現(xiàn)為血管堵塞（F），部分組織細胞空泡樣變性（圓圈），同時中央靜脈中有一定的細胞脫落現(xiàn)象（黑色箭頭）；茶多酚保護組（c）中，只有少量組織出現(xiàn)輕微增生或變性現(xiàn)象（圓圈），其它部分并未表現(xiàn)出異常，損傷程度較染鎘組有所緩解；茶多酚對照組中（d），肝臟組織細胞形態(tài)正常，并未表現(xiàn)出病理現(xiàn)象。

3 討論

鎘作為當(dāng)代使用廣泛的重金屬之一，對工業(yè)產(chǎn)生巨大效益的同時，其對環(huán)境和人體健康的傷害也越來越明顯。機體中的鎘會對組織細胞產(chǎn)生較大的氧化損傷，誘導(dǎo)組織產(chǎn)生活性氧簇（ROS），氧化細胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成器官應(yīng)對氧化脅迫的能力降低[14]。在鎘暴露下，機體各個器官都會受到不同程度的影響，其中肝臟受到的影響最為嚴(yán)重[15]。酚類化合物富含-OH 基團，具有抗氧化和螯合金屬離子的特性，大量研究表明，植物酚類物質(zhì)對氧化應(yīng)激具有較強的調(diào)節(jié)作用。尋找有效預(yù)防和治療鎘中毒的植物酚類化合物是現(xiàn)代毒理學(xué)研究的主要方向之一[16]。已有研究證實類黃酮、花青素等植物酚類成分可以通過誘導(dǎo)抗氧化物酶，降低脂質(zhì)過氧化水平等途徑，保護鎘誘導(dǎo)的機體損傷[17]。茶多酚作為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，有大量試驗研究證實其具有抗腫瘤、抗衰老和調(diào)血脂等多種藥理活性，與茶多酚的抗氧化特性有密切關(guān)系[18]。本試驗采用腹腔注射的方法，對雄性成年小鼠造成鎘暴露，同時通過腹腔注射茶多酚對其進行保護，以評價茶多酚這種植物活性成分對緩解鎘造成的血液及肝臟損傷的保護作用。

圖6 茶多酚對急性鎘暴露小鼠肝臟組織的影響（200 倍）Fig.6 Effect of tea polyphenols on liver tissue in mice exposed to acute cadmium（200 times）

血液數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，急性鎘暴露小鼠紅細胞的滲透脆性顯著升高，紅細胞表面產(chǎn)生海恩茲小體，表面呈刺狀突起，形態(tài)發(fā)生改變。鎘暴露小鼠血清中AST、ALT 兩種轉(zhuǎn)氨酶含量顯著增高。鎘暴露小鼠肝臟組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）含量明顯高于空白對照組，且差異顯著；抗氧化酶SOD、CAT 活性顯著低于空白對照組。與模型組相比，茶多酚保護組可以不同程度減輕由鎘暴露引起的抗氧化酶活的變化，并可減少MDA 含量的增加量，能有效降低血液和肝臟內(nèi)鎘的富集和蓄積，減輕鎘導(dǎo)致的肝臟損傷。結(jié)合本試驗結(jié)果，可以清楚的了解到急性鎘暴露下，對小鼠血液及肝臟功能有一定的損害，對機體氧化還原體系產(chǎn)生了較大的影響，同時擾亂了機體正常的代謝過程，而茶多酚可以有效緩解以上由鎘暴露引起的不良反應(yīng)，減輕鎘對小鼠血液及肝臟的損傷。表明茶多酚作為廣泛存在的抗氧化活性物質(zhì)，對鎘造成的機體損傷有緩解作用，且基本不會對機體造成損害，在抗氧化，緩解重金屬毒性，輔助治療血液及肝臟損傷方面有較大的應(yīng)用前景。