曹青青 陳根生 許勇泉* 尹軍峰

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 國(guó)家茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心 杭州 310008 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 北京 100081）

黃金芽是特殊的光照敏感型、黃色系白化茶樹品種[1]，相較于普通的茶樹栽培種，其葉綠體和類囊體膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得葉綠素合成受阻，從而鮮葉外觀色澤表現(xiàn)為嫩黃且色彩飽和度低[2]。此外，與其它白化茶樹品種一樣，其鮮葉中內(nèi)含物質(zhì)組成也較為特殊，氨基酸含量尤其高，可高達(dá)7%～10%（占干物質(zhì)重），是正常茶鮮葉的2～3 倍，以致其茶湯入口鮮爽，更容易受消費(fèi)者喜歡[3-5]。黃金芽獨(dú)特的外觀色澤與內(nèi)在品質(zhì)使得它一直以來深受廣大茶葉消費(fèi)者的青睞與茶葉研究者的關(guān)注。

黃金芽品種鮮葉在實(shí)際生產(chǎn)中，絕大多數(shù)用于加工綠茶。綠茶典型的“三綠”特征中的“外形綠”主要由脂溶性色素呈現(xiàn)，包括葉綠素類和類胡蘿卜素類化合物，前者主要由葉綠素a/b 構(gòu)成，決定綠茶的綠色度；后者包括β-胡蘿卜素和葉黃素，對(duì)綠茶的黃色度起主導(dǎo)作用[6]。綠茶在加工過程中，脂溶性色素會(huì)發(fā)生劇烈生化反應(yīng)，其中葉綠素主要參與脫鎂反應(yīng)、脫植基反應(yīng)以及氧化降解反應(yīng)[7-8]。肖偉祥等[7]報(bào)道在茶鮮葉貯存或攤放過程中，一方面葉綠素酶會(huì)催化葉綠素發(fā)生脫植基反應(yīng)生成葉綠素酸酯；另一方面葉綠素還會(huì)從葉綠體中解離出來，而游離態(tài)的葉綠素易被光熱環(huán)境氧化，生成無色小分子物質(zhì)，從而葉色變淺。類胡蘿卜素在綠茶加工過程中主要發(fā)生非酶促（光、熱）氧化降解[9]，生成綠茶主要香氣物質(zhì)，如β-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、橙花醇等[10]。此外，β-胡蘿卜素的降解產(chǎn)物還有利于茶黃素和茶紅素的形成，對(duì)干茶外觀的紅亮色澤有影響，這一點(diǎn)在紅茶加工過程中表現(xiàn)得尤其明顯。

初步研究發(fā)現(xiàn)，嫩黃的黃金芽鮮葉在殺青過程中，受熱后顏色發(fā)生顯著變化，呈現(xiàn)鮮綠色，致成品綠茶色澤與其它品種嫩度較高的鮮葉加工而成的干茶并無太大區(qū)別。這樣一來，黃金芽鮮葉嫩黃的外觀色澤優(yōu)勢(shì)無法得到凸顯，嚴(yán)重有礙于其外觀品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值呈現(xiàn)，而相關(guān)研究寥寥無幾。本研究以此為切入點(diǎn)，選擇較為常見的普通（未黃化）茶樹品種——鳩坑作為對(duì)照，研究黃金芽鮮葉在受熱以及后續(xù)綠茶加工和悶黃工序中的色澤變化規(guī)律，深入挖掘色澤變化的機(jī)理，以期能為此類白化茶樹品種鮮葉的生產(chǎn)加工提供一定理論指導(dǎo)，使其色澤特殊性發(fā)揮最大優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃金芽和鳩坑鮮葉原料均為一芽二葉，于2017 年4 月份采摘于宜興太華鎮(zhèn)胥錦茶場(chǎng)。

葉黃素（分析純）、葉綠素b[HPLC（≥90%）]、β-胡蘿卜素[HPLC（≥95%）]等色素標(biāo)品，美國(guó)Sigma 公司；葉綠素a[HPLC（≥90%）]、脫鎂葉綠素a[HPLC（≥90%）]、脫鎂葉綠素b[HPLC（≥90%）]等色素標(biāo)品，日本W(wǎng)AKO 公司；乙腈、乙酸、氯仿、甲醇均為色譜純級(jí)；乙醇、丙酮為分析純級(jí)；純水，杭州娃哈哈集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

X3-233A 微波爐，廣東美的廚房電器制造有限公司；80 型滾筒殺青機(jī)，富陽(yáng)茶葉機(jī)械總廠；茶葉多功能理?xiàng)l機(jī)，浙江恒峰科技開發(fā)有限公司；FTS-13TD 型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)KINETICS 公司；CM-600d 型手持式分光測(cè)色儀，柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；Eppendorf 臺(tái)式高速大容量離心機(jī)5810R，德國(guó)艾本德股份公司；ACQUITY UPLC H-Class 色譜系統(tǒng)，Waters 科技（上海）有限公司；研缽。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶葉樣品制備 采摘后的鮮葉室溫?cái)偡?2 h 后，分別制備樣品，具體操作步驟如下：

1）鮮葉樣品 取樣后的鮮葉液氮罐低溫保存48 h，隨后真空冷凍干燥。

2）鮮葉加熱處理樣品 取樣后的鮮葉進(jìn)行微波加熱，微波爐高火（900 W）加熱30 s，取出攤晾至室溫（該過程重復(fù)3 次），最終待冷卻至室溫后放入液氮罐低溫保存48 h，隨后與鮮葉一起真空冷凍干燥。

3）未悶黃處理樣品 攤放12 h 后的鮮葉按綠茶加工工藝：殺青—輕揉捻—烘干制備成綠茶樣。

4）悶黃處理樣品 攤放12 h 后的鮮葉按黃茶加工工藝：殺青—45 ℃悶黃3 h—輕揉捻—烘干制備成黃茶樣。

1.3.2 色差測(cè)定 采用L*a*b 色差系統(tǒng)直接測(cè)定干茶色差，每次取樣前用手持式分光測(cè)色儀任取6 點(diǎn)測(cè)定即時(shí)色差，其中L*值代表亮度；a*代表紅綠色度，“+”表示紅色，“-”表示綠色；b*代表黃藍(lán)色度，“+”表示黃色，“-”表示藍(lán)色；h°代表色度角。

1.3.3 色素測(cè)定

1）標(biāo)準(zhǔn)品配制 葉黃素、葉綠素a/b、脫鎂葉綠素a/b 以及β-胡蘿卜素共6 種色素標(biāo)準(zhǔn)品，首先均用乙醇配制成0.1 mg/mL 的母液備用，然后繼續(xù)用乙醇稀釋100 倍后上機(jī)使用。

2）樣品前處理 稱取各茶葉樣品約0.500 g（精確記錄數(shù)值備用），弱光環(huán)境下加適量石英砂研磨成粉末，每次加5 mL 80%冰丙酮（配制80%丙酮水溶液于4 ℃冰箱靜置過夜后使用，使用過程中冰浴處理）水溶液避光提取2 h，然后5 000 r/min 離心10 min 轉(zhuǎn)移上清液于25 mL 棕色容量瓶，提取過程可重復(fù)5 次直到茶渣完全泛白，提取過程中以避光靜置為主，0.5 h/次間隔輔助人工振蕩效果較佳，最終用80%冰丙酮定容后獲得色素提取液。色素提取液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)膜過濾后方可進(jìn)樣檢測(cè)。

3）色譜條件 采用Waters 的ACQUITY UPLC H-Class 色譜系統(tǒng)，色譜方法參考潘順順等[11]優(yōu)化改動(dòng)后如下。色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫：35 ℃；流速：0.413 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210～600 nm 全掃；流動(dòng)相A 為3∶0.5∶96.5（體積比）的乙腈、乙酸和水的混合液，流動(dòng)相B 為75∶15∶10（體積比）的乙腈、甲醇和氯仿混合液。洗脫梯度如表1 所示。

表1 UPLC 流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 UPLC elution programs

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 各試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，數(shù)據(jù)基礎(chǔ)分析采用Microsoft Excel 2016；作圖采用GraphPad Prism 7.00；t 檢驗(yàn)、單因素方差分析及LSD 多重比較均采用SAS 9.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC 脂溶性色素分離方法的確定

茶葉樣品中包括葉黃素、葉綠素a/b、脫鎂葉綠素a/b 以及β-胡蘿卜素等的6 種脂溶性色素含量測(cè)定參考潘順順等[11]的HPLC 色素分析方法。保留原始流動(dòng)相成分，即以3∶0.5∶96.5（體積比）的乙腈、乙酸和水的混合液為流動(dòng)相A，以75∶15∶10（體積比）的乙腈、甲醇和氯仿混合液為流動(dòng)相B，在此基礎(chǔ)之上優(yōu)化轉(zhuǎn)換成UPLC 法。使用Acquity UPLC HSS T3 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫35 ℃，流速0.413 mL/min，線性洗脫梯度如表1 所示。在該色譜條件下，6 種色素的分離效果與效率明顯提高（圖1），原方法40 min 的洗脫任務(wù)現(xiàn)12 min 內(nèi)能完成，6 種色素：葉黃素、葉綠素b、葉綠素a、脫鎂葉綠素b、脫鎂葉綠素a 以及β-胡蘿卜素的保留時(shí)間分別為2.163，3.452，6.328，7.221，7.770，9.043 min。

圖1 UPLC 色素洗脫效果圖Fig.1 Pigments separation in UPLC

2.2 黃金芽與鳩坑品種的色澤區(qū)別

黃金芽與鳩坑品種的鮮葉以及后續(xù)各加工過程的成品茶外觀色澤均差異顯著（圖2）。黃金芽品種鮮葉制備的各樣品L*/a*/b*值普遍高于鳩坑組樣品（圖3a～3d），說明黃金芽組樣品光澤度較好，亮度高，色彩上黃色度更高。其中，a*值隨處理或加工方式不同變動(dòng)最大，鮮葉狀態(tài)下的黃金芽a*值（2.312±1.691）為正值而鳩坑（-4.606±1.327）為負(fù)值，微波加熱后鳩坑（-3.593±0.821）值略有增大，而黃金芽（-3.166±0.743）則從正值銳減至負(fù)值甚至與鳩坑之間無顯著差異（P＞0.05），未悶黃處理組樣品依然呈現(xiàn)一正一負(fù)，而悶黃處理后二者都顯著增大并均呈正值（黃金芽2.222±0.390，鳩坑1.662±0.288）。對(duì)應(yīng)圖2 的視覺效果，鮮葉狀態(tài)下嫩黃色的黃金芽和綠色的鳩坑，加熱后變?yōu)轷r綠色的黃金芽和較為暗綠的鳩坑，未悶黃處理為黃綠色的黃金芽和深綠色的鳩坑，以及悶黃處理后二者均呈現(xiàn)的以黃色為主的色調(diào)。整體來說，微波加熱及未悶黃處理均會(huì)導(dǎo)致黃金芽顏色變綠而鳩坑顏色變黃。

圖2 黃金芽與鳩坑品種鮮葉及干茶圖片F(xiàn)ig.2 The pictures of tea samples made from Huangjinya and Jiukeng cultivars

圖3 黃金芽與鳩坑品種鮮葉及干茶色差Fig.3 The chromatism of tea samples made from Huangjinya and Jiukeng cultivars

這些表觀色澤的變化現(xiàn)象可以追溯到其內(nèi)含色素成分的變化。UPLC 的色素?cái)?shù)據(jù)結(jié)果（圖4）顯示，從鮮葉到干茶的各個(gè)環(huán)節(jié)中，黃金芽品種葉片的各色素含量均顯著低于鳩坑品種（圖4a～4d），包括葉黃素、葉綠素a/b、脫鎂葉綠素a/b 以及β-胡蘿卜素。這與Wang 等[12]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)同樣是白化茶樹品種的中黃2 號(hào)鮮葉的各色素（包括葉綠素a/b、葉黃素和β-胡蘿卜素）含量水平均顯著低于常規(guī)茶樹品種的龍井43 號(hào)。Feng等[13]報(bào)道黃金芽、天臺(tái)黃、郁金香等白化茶樹品種中葉綠素a/b、葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素以及堇菜黃素的含量都顯著低于福鼎大白茶。因?yàn)檫@些白化茶樹品種受外界因素或是自身遺傳因素的影響，導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)受損、葉綠素合成受阻，以致其色素含量組成較為特殊[14]。此外，黃金芽和鳩坑品種鮮葉中均含有微量脫鎂葉綠素a（黃金芽1.973 mg/100 g，鳩坑26.322 mg/100 g），而未檢測(cè)到脫鎂葉綠素b 的存在（圖4a）。這可能與本研究中的鮮葉處理有關(guān)，由于在鮮葉室溫?cái)偡胚^夜后取樣，而鮮葉在攤放貯存過程中已經(jīng)開始內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化了，包括葉綠素的降解。葉綠素降解時(shí)，葉綠素b 會(huì)先轉(zhuǎn)化成葉綠素a 而后再進(jìn)行降解[15]，進(jìn)而生成脫鎂葉綠素、脫植基葉綠素等，因此導(dǎo)致研究中出現(xiàn)的黃金芽與鳩坑鮮葉中均存在少量脫鎂葉綠素a 而無脫鎂葉綠素b 的結(jié)果。

根據(jù)綠色素和黃色素組分的相對(duì)含量（圖4e～4h），發(fā)現(xiàn)黃金芽品種的葉片中葉黃素、β-胡蘿卜素等黃色素組分相對(duì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鳩坑種，而葉綠素a/b 和脫鎂葉綠素a/b 等綠色素總量恰恰相反。這或許就是黃金芽品種鮮葉以及后續(xù)各工序樣品的外觀看起來要比鳩坑種普遍偏黃，且色彩飽和度偏低的原因所在。

圖4 黃金芽與鳩坑品種鮮葉及干茶的色素含量Fig.4 The pigments content of tea samples made from Huangjinya and Jiukeng cultivars

2.3 加熱對(duì)鮮葉色澤的影響

黃金芽鮮葉微波加熱處理后，外觀色澤由嫩黃色蛻變成鮮綠色（圖2a 和2b），正如圖5a 顯示，加熱可使鮮葉色差參數(shù)a*由正（2.312）轉(zhuǎn)負(fù)（-3.166），色度角h°顯著升高（P＜0.0001）。而鳩坑品種鮮葉加熱后，外觀色澤除了亮度降低（P＜0.001）外并無顯著變化，整體色澤依然是綠色。結(jié)果表明，鳩坑品種鮮葉的色澤熱穩(wěn)定性更高。

圖5 加熱處理對(duì)鮮葉色差的影響Fig.5 The effect of thermal treatment on chromatism of tea samples

圖6 中顯示的色素含量數(shù)據(jù)結(jié)果有所不同，加熱后，黃金芽鮮葉各色素含量變化程度遠(yuǎn)小于鳩坑品種（圖6a 和6b）。前者的葉黃素（P＜0.001）、脫鎂葉綠素a（P＜0.001）以及β-胡蘿卜素（P＜0.01）含量加熱后都顯著下降，而加熱后的鳩坑品種鮮葉除了葉黃素以外，其它5 種色素（包括葉綠素a/b、脫鎂葉綠素a/b 以及β-胡蘿卜素）含量均顯著上升。黃金芽與鳩坑品種鮮葉加熱后各色素含量變化之間的差異或許是由二者不同的生理結(jié)構(gòu)造成，使得鳩坑品種鮮葉色素的耐熱性更強(qiáng)。鳩坑鮮葉的葉綠素a/b 含量加熱后顯著升高似乎有違常理，這與Pumilia 等[16]的研究頗有相似之處，該研究發(fā)現(xiàn)于138 ℃烘焙5 min 的開心果中葉綠素a/b含量反而比鮮果原料更高。其原因在于高溫作用下葉綠素-蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得葉綠素呈游離狀態(tài)，同時(shí)也更易于浸提[17]。然而，游離態(tài)的葉綠素穩(wěn)定性更差，更容易受光熱作用發(fā)生降解，生成脫植基葉綠素、脫鎂葉綠素等，這可能也是圖6b 中鳩坑鮮葉加熱后脫鎂葉綠素含量顯著升高的原因。

相較于上述的各色素變化情況，黃金芽與鳩坑鮮葉的綠色素和黃色素相對(duì)含量變化趨勢(shì)（圖6c 和6d）較為相似。微波加熱處理使得黃金芽（P＜0.05）與鳩坑（P＜0.001）品種鮮葉的綠色素相對(duì)含量顯著提高而黃色素含量則顯著降低，從而綠色素/黃色素比值均得以提高，鳩坑品種的變化尤其顯著。相較于黃金芽，色素組分變化更顯著的鳩坑鮮葉外觀色澤反而變化甚微，由此推斷鳩坑品種鮮葉中，除本研究6 種色素以外還含有大量其它呈色物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在在一定程度上可對(duì)高溫短時(shí)加熱引起的變化起到暫時(shí)的緩沖作用，而黃金芽由于先天的特殊性，這種“緩沖作用”微乎其微。

此外，正如前文所提及，黃金芽和鳩坑品種鮮葉中均沒有檢測(cè)到脫鎂葉綠素b 的存在，鳩坑品種鮮葉在加熱后大量出現(xiàn)脫鎂葉綠素b，而黃金芽并沒有。這或許是由于黃金芽鮮葉內(nèi)缺少轉(zhuǎn)變?yōu)槊撴V葉綠素b 的前體物質(zhì)或該轉(zhuǎn)化過程的必要物質(zhì)，對(duì)此并無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

2.4 悶黃對(duì)干茶色澤的影響

黃金芽品種鮮葉經(jīng)未悶黃處理后，外觀色澤由黃變綠（圖2a 和2c），對(duì)應(yīng)的色差參數(shù)L*/a*/b*/C*值均顯著減?。▓D7a），由此，其鮮葉原本特殊的色澤優(yōu)勢(shì)難以凸顯。若采用悶黃處理，這一問題可得到有效解決。如圖7a，悶黃處理后的黃金芽干茶色差的各項(xiàng)指標(biāo)相較于未悶黃處理組均與鮮葉差異更小，成品茶外觀色澤更黃亮均勻（圖2d）。于是，推斷悶黃處理可以最大化地發(fā)揮黃金芽品種乃至是該類白化茶樹品種鮮葉的特殊色澤優(yōu)勢(shì)。而鳩坑品種鮮葉在處理過程中，色差指標(biāo)L*/b*/C*/h°均會(huì)顯著減小，而a*值由負(fù)轉(zhuǎn)正（圖7b），對(duì)應(yīng)干茶的視覺效果由原本鮮葉的深綠色（圖2e）明顯變淺（圖2g）轉(zhuǎn)而向黃色（圖2h）發(fā)展，并且色澤變暗，而悶黃處理對(duì)此并無顯著改善，反而有加劇這一變化程度的趨勢(shì)。這一點(diǎn)，或許正是由于上文所推斷，鳩坑品種鮮葉含量豐富的各色素物質(zhì)雖然能夠有效緩沖短時(shí)高溫加熱引起的變化，但對(duì)于漫長(zhǎng)的熱加工過程卻適得其反，而黃金芽品種恰恰是因?yàn)楦魃睾肯∩?，反而在加工過程中表現(xiàn)得較為穩(wěn)定。

圖6 加熱處理對(duì)鮮葉色素含量的影響Fig.6 The effect of thermal treatment on pigments content of tea samples

圖7 悶黃處理對(duì)干茶色差的影響Fig.7 The effect of piling treatment on chromatism of tea samples

圖8 的色素含量數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，悶黃或未悶黃處理都會(huì)使得鮮葉中的各色素含量發(fā)生顯著變化，且黃金芽與鳩坑變化趨勢(shì)基本保持一致。其中，葉黃素和β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素含量水平在處理過程中均會(huì)顯著降低（圖8a 和8b），因?yàn)椴枞~干燥過程中的高溫濕熱作用易使類胡蘿卜素發(fā)生氧化降解，而這也正是茶葉香氣形成的關(guān)鍵過程[18]。而葉綠素變化情況較為復(fù)雜，未悶黃處理可使葉綠素a/b 和脫鎂葉綠素a/b 含量水平均顯著提高，而悶黃處理反而使得這些色素含量顯著降低（圖8a 和8b）。結(jié)果導(dǎo)致悶黃處理的黃金芽各色素含量以及兩大類色素相對(duì)含量水平均與鮮葉狀態(tài)下無顯著差異（圖8a 和8c）。由此可見，悶黃處理更有利于黃金芽鮮葉色澤優(yōu)勢(shì)的凸顯。

圖8 悶黃處理對(duì)干茶色素含量的影響Fig.8 The effect of piling treatment on pigments content of tea samples

3 結(jié)論

黃金芽，作為白化茶樹品種之一，相較于常規(guī)茶樹品種外觀色澤具有一定特殊性，呈現(xiàn)嫩黃色且亮度、光澤度較佳。然而，黃金芽鮮葉經(jīng)過加熱或是殺青后其色澤發(fā)生顯著變化，轉(zhuǎn)而呈現(xiàn)鮮綠色；黃金芽鮮葉按正常綠茶工藝加工所得的成品茶與其它嫩度較好的常規(guī)名優(yōu)綠茶并無太大區(qū)別，因此其色澤特殊性的優(yōu)勢(shì)未能最大化發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，黃金芽鮮葉加熱后之所以色澤由嫩黃轉(zhuǎn)變?yōu)轷r綠，是因?yàn)橐匀~黃素為代表的黃色素含量顯著降低，致使綠色素/黃色素比值顯著升高。而黃金芽鮮葉在加工初期受熱后色澤變綠的情況，可在后續(xù)的悶黃工藝中得到有效改善，使得悶黃處理后的成品茶相較于未悶黃的茶葉，外觀色澤與內(nèi)在色素含量均與鮮葉狀態(tài)差異更小，由此可見，悶黃處理有利于黃金芽乃至此類白化茶樹品種鮮葉的色澤優(yōu)勢(shì)在成品茶中更好地呈現(xiàn)。