李洪波 李春爽 張?zhí)扃?韓翼宇 李紅娟 于景華

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457）

益生菌是指服用足夠量時(shí)，能對(duì)人體產(chǎn)生有益作用的一類活的微生物[1]。益生菌分布廣泛，種類繁多，常見的有乳桿菌、雙歧桿菌及部分革蘭氏陽性球菌[2-3]。益生菌對(duì)人體健康有多方面的積極作用，如提高人體免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道功能，降低過敏反應(yīng)，降低膽固醇，維持腸道菌群平衡及防癌、抗癌等功能[4-5]。益生菌的這些功能使得它在食品中得到越來越多的應(yīng)用，使用范圍也日益擴(kuò)大。

實(shí)現(xiàn)益生菌眾多功能的基礎(chǔ)是腸道中含有一定數(shù)量的益生菌。然而，傳統(tǒng)方法應(yīng)用時(shí)益生菌在生長過程中耐酸性差，對(duì)氧敏感，活性保持困難[6]。如何提高益生菌制品中的活菌數(shù)，提高菌體的耐酸性及膽汁的耐受性，成為亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，一些低聚糖、微藻及某些天然植物進(jìn)入人體后不易被機(jī)體消化，也不被有害菌利用，然而，可以選擇性刺激腸道中的一種或多種益生菌群的生長或增強(qiáng)益生菌的活性，使其成為腸道優(yōu)勢菌群，這種物質(zhì)被稱為益生元[7]。乳糖醇是由半乳糖和山梨醇組成的雙塘，具有β-半乳糖苷鍵[8]。乳糖醇在小腸內(nèi)不被消化，可以被結(jié)腸中的乳酸菌發(fā)酵。作為益生元，乳糖醇能夠促進(jìn)益生菌，如雙歧桿菌和乳酸桿菌在結(jié)腸中的生長，也能選擇性地減少腐敗細(xì)菌的數(shù)量，從而降低腸道pH 值以及氨的產(chǎn)生和吸收；乳糖醇還可以促進(jìn)腸道對(duì)鈣、鎂離子的吸收[9-10]。與其它多元醇類似，乳糖醇是安全的，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)“未指定”其每日允許攝入量[10]。而合生元作為益生菌和益生元的混合制劑，不僅具有益生菌的生理功能，還可發(fā)揮益生元的生理作用[11]。

微膠囊為益生菌提供了一個(gè)相對(duì)適宜的微環(huán)境，使菌體與相對(duì)惡劣的外界環(huán)境隔離開，合生元的微膠囊化不僅可以提高益生菌在胃腸道中的存活率，還可以改善不同類型微生態(tài)制劑的貨架穩(wěn)定性[12-13]。內(nèi)源乳化法因制備的微膠囊粒徑小，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。蛋白質(zhì)，尤其是牛奶蛋白，因其食用的安全性和所形成的凝膠具有良好的pH 敏感性，可控的通透性和較高的凝膠強(qiáng)度，本身的自我組裝及離子結(jié)合能力，對(duì)于胃酸環(huán)境優(yōu)良的緩沖能力等特點(diǎn)，而受到越來越多的關(guān)注。通過酶、酸以及金屬離子的交聯(lián)作用，蛋白質(zhì)可在室溫下形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠，同時(shí)反應(yīng)條件溫和，因此蛋白質(zhì)成為極具前景的益生元包埋壁材[14]。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13）是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，它可以通過谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基（氨基受體）和賴氨酸殘基的ε-氨基或其它伯胺基（氨基供體）之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成ε-（γ-谷氨基）賴氨酸異肽鍵，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的交聯(lián)[15]。這種交聯(lián)作用可以溫和地將蛋白/益生菌混合物液滴轉(zhuǎn)化為膠囊化的粒子[16]。利用海藻酸鈉進(jìn)行二次包埋可以保護(hù)膠囊免受胃蛋白酶的作用，從而避免蛋白膠囊的崩解[17]。

黏玉米來源TGase（TGZ）是一種植物來源的TGase。目前本課題組將TGZ 在畢赤酵母中進(jìn)行可溶性表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)7.6 mg/L，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行初步研究[18]。研究表明，同微生物來源TGase（MTG）一樣，酪蛋白是TGZ 作用的良好底物[19]。本試驗(yàn)以重組TGZ 為催化劑，以酪蛋白為壁材通過內(nèi)源乳化法包埋干酪乳桿菌/乳糖醇合生元制備微膠囊，并用海藻酸鈉進(jìn)行微膠囊的二次包衣，通過微膠囊粒徑和益生菌在模擬胃腸液中的存活率考察包埋效果。最后，將制備的微膠囊添加到橙汁飲料中，對(duì)貯存條件下橙汁中干酪乳桿菌的存活量進(jìn)行研究，為其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料和試劑

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei 28-2）為本實(shí)驗(yàn)室自行分離與保存。TGZ 來自重組畢赤酵母，酶活性為1 078 mU/mL，產(chǎn)量為7.6 mg/L。

酪蛋白酸鈉，北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司；乳糖醇，上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，Sigma-Aldrich；大豆油，當(dāng)?shù)爻?；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、潔凈工作臺(tái)、立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)器，天津歐諾儀器股份有限公司；激光粒度分布儀，丹東百特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備 活化好的干酪乳桿菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h 后，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2 次后分別重懸于0，5.0，10，15，20 g/100 mL 和25 g/100 mL 的乳糖醇溶液，制備菌懸液。

1.3.2 合生元的單層包埋 配制10 g/100 mL 的酪蛋白溶液，于4 ℃攪拌過夜達(dá)到完全水合。用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0。分別取2 mL 的濃縮菌液與18 mL 的酪蛋白溶液混合，使其菌數(shù)在1010CFU/mL，乳糖醇濃度分別在0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/100 mL 和2.5 g/100 mL。加入TGZ，使其終濃度為15 U/g，混合均勻后，迅速倒入預(yù)熱（42 ℃）的大豆油中，并置于磁力攪拌器（600 r/min，42 ℃）攪拌4 h。攪拌過程中，TGZ 催化酪蛋白包埋合生元乳化的液滴，形成膠體顆粒。500 g 離心5 min 收集膠體顆粒，用無菌生理鹽水洗滌3 次，重新收集膠體顆粒，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 合生元的雙層包埋 15 g 酪蛋白包埋的膠體顆粒加入到100 mL 1.0 g/100 mL 的海藻酸鈉溶液，置于磁力攪拌器（600 r/min）攪拌30 min。700 g 離心5 min 收集微膠囊，然后懸浮于100 g含有0.05%吐溫80 和1.11%CaCl2的大豆油中，繼續(xù)攪拌30 min。添加200 mL 1.11%CaCl2到混合液中打破乳化，500 g 離心5 min 收集雙層包埋微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3 次，重新收集微膠囊，4 ℃貯存?zhèn)溆?。用激光粒度分布儀對(duì)雙層包埋微膠囊進(jìn)行粒徑的測量。

1.3.4 包埋率的測定 將微膠囊和裂解液（0.06 mol/L 檸檬酸鈉和0.2 mol/L 碳酸氫鈉）混合，于37℃緩慢攪拌1 h 弱化海藻酸鈉的交聯(lián)作用。把0.5 g 弱化后的微膠囊加入到4.5 mL 磷酸鹽緩沖液中（pH 6.8），用高速均質(zhì)機(jī)破碎微膠囊，37 ℃恒溫振蕩30 min，釋放包埋的干酪乳桿菌28-2。稀釋混合液涂布MRS 平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。包埋率按公式（1）計(jì)算。

式中，N——包埋后微膠囊中的活菌數(shù)；N0——包埋前的活菌數(shù)。

1.3.5 微膠囊在模擬胃腸液中的存活實(shí)驗(yàn) 模擬胃液和模擬腸液的配制方法參照文獻(xiàn)[20]配制。0.5 g 微膠囊溶于9.5 mL 模擬胃液中，37 ℃，100 r/min 恒溫振蕩30，60，90，120 min。收集微膠囊重懸于9.5 mL 模擬腸液中，37 ℃，100 r/min 恒溫振蕩4 h。稀釋混合液涂布MRS 平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.6 微膠囊形態(tài)分析 將新鮮制備的微膠囊用戊二醛溶液固定后，在pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液中洗滌，用不同濃度的乙醇溶液梯度脫水、氯仿脫脂，進(jìn)行冷凍干燥。將干燥樣品進(jìn)行離子濺射噴金，用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊的形態(tài)。

1.3.7 合生元微膠囊的應(yīng)用研究 將10 g 微膠囊加入到100 mL 橙汁中，4 ℃貯存28 d。分別于第1，7，14，21，28 天取樣進(jìn)行菌數(shù)測定，方法同1.3.4節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊粒徑和包埋率 用激光粒度分布儀對(duì)包埋的微膠囊進(jìn)行粒徑的測量。由表1 可知，沒有添加乳糖醇時(shí)，微膠囊的粒徑最?。?00.5 μm）。添加乳糖醇后，微膠囊粒徑顯著增大（340.3～372.9 μm）。乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時(shí)，粒徑最小，為340.3 μm，乳糖醇添加量為2.5 g/100 mL 時(shí)，粒徑達(dá)到最高值372.9 μm。

表1 乳糖醇添加量對(duì)微膠囊包埋率和粒徑的影響Table 1 Effect of different lactitol concentrations on the encapsulation efficiency and particle size

包埋率是評(píng)價(jià)微膠囊質(zhì)量的重要指標(biāo)。包埋率越高，說明益生菌與外界環(huán)境接觸越少，對(duì)益生菌的保護(hù)作用越強(qiáng)[14]。由表1 可知，包埋前干酪乳桿菌的活菌數(shù)差異不顯著，在10.91～10.93 lg（CFU/g）。包埋后活菌數(shù)均有所下降，添加2.5 g/100 mL 乳糖醇時(shí)，下降最顯著，包埋率為11.41%。乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時(shí)，包埋率最高（61.73%），顯著高于未添加乳糖醇的46.34%。很多因素影響益生菌的包埋率，如包埋前益生菌數(shù)量、益生元類型、包埋方式、壁材種類等。有文獻(xiàn)報(bào)道，益生元（Hi-maize）可以顯著提高益生菌的包埋率和存活率[21]，然而也有研究表明益生元（槲黃素）的存在降低了益生菌的包埋率和存活率[22]。本試驗(yàn)中，乳糖醇的添加易于干酪乳桿菌的包埋，這可能是由于乳糖醇的存在增大了微膠囊粒子的體積，使更多益生菌被包埋，從而提高了包埋率。過高的添加量雖然增大了微膠囊的體積，但是也使得更多的乳糖醇包埋于粒子中，反而降低了包埋率。

2.2 包埋后干酪乳桿菌在模擬胃腸液中的存活量

圖1 酪乳桿菌在模擬胃腸液中的活菌數(shù)的變化Fig.1 Number of survival cells of microencapsulated L.casei after incubation in stimulated gastrointestinal condition

包埋后干酪乳桿菌對(duì)胃腸道的耐受性如圖1所示。隨著微膠囊在模擬胃液中作用時(shí)間的延長，干酪乳桿菌的存活數(shù)有所下降。未添加乳糖醇的干酪乳桿菌的活菌數(shù)最少為4.97 lg（CFU/g），添加乳糖醇后的活菌數(shù)為6.66～8.08 lg（CFU/g），均顯著高于對(duì)照菌數(shù)。添加乳糖醇后干酪乳桿菌活菌數(shù)在模擬胃液中處理90 min 后開始上升。低濃度（0.5 g/100 mL）時(shí)，上升速度緩慢，到120 min 后，僅增加了0.89 個(gè)對(duì)數(shù)值。添加量為1.0 g/100 mL時(shí)，活菌數(shù)增長最顯著，為2.35 個(gè)對(duì)數(shù)值。之后，隨著乳糖醇添加量的增加，增長速度開始減慢，添加量為2.5 g/100 mL 時(shí)，增長量為0.98 個(gè)對(duì)數(shù)值。模擬胃腸道耐受性結(jié)果表明，乳糖醇的添加可以增加干酪乳桿菌對(duì)胃腸道的耐受性，這與其它關(guān)于益生元增加益生菌耐受性的報(bào)道結(jié)果一致[23]。另外，乳糖醇的添加還可以增加干酪乳桿菌在模擬胃腸道中的存活菌數(shù)。乳糖醇是一種乳糖衍生的糖醇，可作為益生菌發(fā)酵的碳源。Kontula 等[24]早在1999 年就報(bào)道過乳酸菌利用乳糖生長繁殖，隨后有許多關(guān)于乳糖醇促進(jìn)益生菌生長的報(bào)道。研究表明，乳糖醇可以促進(jìn)乳酸桿菌（如鼠李糖乳桿菌）、雙歧桿菌（幼兒雙歧桿菌）的生長，這可能是因?yàn)槿樘谴伎梢员桓衫胰闂U菌利用，減少氨的形成，改變腸道pH 值，從而促進(jìn)了干酪乳桿菌的生長[10，25]。對(duì)乳糖醇/嗜酸乳桿菌NCFM 合生元組合的研究表明，其在人類結(jié)腸模型和臨床干預(yù)中發(fā)揮了一定的功能特性[26-27]。同時(shí)微膠囊緊密的抗穿透表面可以作為一個(gè)強(qiáng)大的物理屏障，在通過胃腸道時(shí)保護(hù)益生菌細(xì)胞，提高其存活率。綜合上述結(jié)果可知，乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時(shí)，其粒徑最小，包埋率最高，對(duì)胃腸道的耐受性最好。

2.3 微膠囊形態(tài)分析

由于冷凍干燥過程會(huì)導(dǎo)致膠囊收縮和不規(guī)則形狀的形成乃至膠囊破碎，因此使用戊二醛將微膠囊固定，保證微膠囊能夠在掃描電鏡下觀察到較為完整的結(jié)構(gòu)，掃描電鏡結(jié)果見圖2。由圖2 可知雙層包埋的乳糖醇/干酪乳桿菌合生元微膠囊及干酪乳桿菌微膠囊均呈球形，有完整的結(jié)構(gòu)。兩種微膠囊的表面未觀察到乳酸菌，表明干酪乳桿菌完全被包埋壁材捕獲，存在于微膠囊內(nèi)部。與乳酸菌微膠囊相比（圖2a 和2b），添加乳糖醇后，微膠囊的聚集更加明顯，且表面出現(xiàn)少許凹陷和明顯褶皺（圖2c 和2d）。這可能是由于微膠囊形成過程中碳水化合物含量較高所致。

圖2 微膠囊的掃面電鏡分析Fig.2 SEM images of freeze dried alginate-coated microcapsules

2.4 微膠囊在橙汁中的應(yīng)用

將含有1.0 g/100 mL 乳糖醇的合生元雙層包埋后，添加到橙汁中進(jìn)行貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果如圖3 所示。在4 ℃貯存28 d 期間，不含乳糖醇橙汁中的干酪乳桿菌的活菌數(shù)呈下降趨勢，最終從9.94 lg（CFU/g）降低到9.14 lg（CFU/g）。添加乳糖醇橙汁的最初干酪乳桿菌含量為9.89 lg（CFU/g），28 d 后的活菌數(shù)為9.65 lg（CFU/g），兩者差異不顯著，說明乳糖醇的添加可以提高干酪乳桿菌在橙汁中的穩(wěn)定性。28 d 后，添加乳糖醇比未添加乳糖醇的活菌數(shù)高0.56 個(gè)對(duì)數(shù)值。Krasaekoopt 和Watcharapoka[28]的研究結(jié)果顯示，4 ℃貯存28 d 后添加低聚半乳糖的益生菌比未添加的干酪乳桿菌高0.4 個(gè)對(duì)數(shù)值，比嗜酸乳桿菌高0.5 個(gè)對(duì)數(shù)值。說明益生元的添加可以提高微膠囊在橙汁中的貯藏穩(wěn)定性。

圖3 橙汁貯存期間干酪乳桿菌活菌數(shù)的變化（4 ℃，28 d）Fig.3 Number of L.casei in orange juice during storage at 4°C for 28 d

3 結(jié)論

本研究用黏玉米來源TGase 作為催化劑交聯(lián)酪蛋白包埋干酪乳桿菌/乳糖醇合生元，用海藻酸鈉為壁材進(jìn)行二次包埋后獲得了合生元雙層微膠囊。結(jié)果表明，乳糖醇添加量為1.0 g/100 mL 時(shí)，微膠囊的粒徑最小，包埋率最大，可有效提高干酪乳桿菌在模擬胃腸道條件下的存活率。掃面電鏡結(jié)果證實(shí)了壁材對(duì)干酪乳桿菌的完全捕獲。橙汁貯存試驗(yàn)表明，添加乳糖醇后，干酪乳桿菌活菌數(shù)在4 ℃貯存28 d 后，僅下降了0.24 個(gè)對(duì)數(shù)值。乳糖醇的添加可以增加益生菌對(duì)外界環(huán)境的耐受性，有助于益生菌的生長，這為乳糖醇合生元產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。