陳嘉琪，崔樹(shù)茂，唐鑫，劉小鳴，趙建新，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

德式乳桿菌保加利亞亞種是一種常用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的乳酸菌。除了產(chǎn)生乳酸外，德式乳桿菌保加利亞亞種還普遍具有良好的蛋白質(zhì)水解體系[1]，其蛋白水解體系主要包括：將大分子蛋白水解成多肽的胞外蛋白酶、將多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、將多肽進(jìn)一步水解成寡肽或氨基酸的肽酶。氨肽酶是一類(lèi)從肽鏈的氨基末端水解肽并釋放N端氨基酸的酶，是蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，包括特異性較差的金屬氨肽酶PepN和巰基氨肽酶(半胱氨酸氨肽酶)PepC和絲氨酸酶X-脯氨酰二肽氨基肽酶PepX[2-3]。PepN和PepC能夠水解2～12個(gè)氨基酸組成的寡肽[4]，但是對(duì)含有脯氨酸(Pro)的氨基肽酶底物活性較低；而PepX能夠從富含脯氨酸的乳清蛋白寡肽中釋放X-Pro二肽，其對(duì)Gly-Pro-對(duì)硝基苯胺(pNA)以及其他X-Pro-pNA底物均具有高活性[5]。

乳清蛋白的主要成分β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)是主要過(guò)敏原之一[6-9]。在超過(guò)80%的牛乳過(guò)敏病例中，β-Lg是兒童和嬰兒牛奶過(guò)敏的主要誘因。而人群研究結(jié)果表明，牛奶過(guò)敏患者中α-La特異性血清免疫球蛋白E的患病率為27.6%～62.8%[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白水解酶具有降解牛奶蛋白過(guò)敏原的能力，德式乳桿菌保加利亞亞種可通過(guò)水解α-La和β-Lg，有效降低乳清蛋白的過(guò)敏性。BU等[11]的研究結(jié)果表明，經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵后，乳清蛋白的抗原性顯著降低，α-La和β-Lg的抑制率分別為53%和89%(P<0.05)。此外，保加利亞乳桿菌發(fā)酵還可提高α-La和β-Lg的消化率，降低乳清蛋白的抗原性。KLEBER等[9]發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌聯(lián)合發(fā)酵對(duì)降低甜乳清和脫脂乳中的β-lg抗原性也非常有效。

雖然前期研究發(fā)現(xiàn)了德氏乳桿菌保加利亞亞種在乳清蛋白水解方面的應(yīng)用潛力，但是尚未闡釋發(fā)酵過(guò)程中菌株的氨肽酶活力與乳清蛋白水解能力之間的相關(guān)性。因此本文選取了8株德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，檢測(cè)其在乳清蛋白培養(yǎng)體系中的3種主要氨肽酶PepN、PepC和PepX活力變化情況，探討不同菌株氨肽酶活力變化與乳清蛋白水解能力之間的相關(guān)性，進(jìn)一步探討應(yīng)用德式乳桿菌保加利亞亞種制備低致敏性發(fā)酵乳清蛋白飲料的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

WPI(分離乳清蛋白，美國(guó)安格普有限公司，貨號(hào)LE 007-7-297，主要成分包括蛋白干態(tài)(Nx6.38)95.7%，水分4.4%，灰分1.7%，脂肪0.4%，乳糖0.2%)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒P0010(上海碧云天有限公司)；氨肽酶底物L(fēng)-賴氨酸-對(duì)硝基苯胺(L-Lys-pNA)；H-精氨酸-對(duì)硝基苯胺(H-Arg-pNA)；H-甘氨酰-脯氨酸-對(duì)硝基苯胺(H-Gly-Pro-pNA)(江蘇吉泰肽業(yè)有限公司)；5’-磷酸吡哆醛、苯丙酮酸鈉、對(duì)硝基苯胺(阿拉丁試劑有限公司)；MRS培養(yǎng)基、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、1水合α-乳糖、MnSO4·H2O、吐溫80、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、L-苯丙氨酸、α-酮戊二酸、EDTA二鈉、乙腈、三氟乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。以上均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)所使用的8株德式乳桿菌保加利亞亞種均保存于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心，其中6株分離篩選自中國(guó)青海西寧、四川阿壩及新疆塞鈴木的牦牛酸奶和牦牛曲拉，菌株保藏編號(hào)分別為DQHXNS1L2、DQHXNS8L6、DQHXNS15M2、DXJSLMS1M5、DSCAB10M20和D11M188，2株對(duì)照菌株編號(hào)分別為L(zhǎng)b.2038(分離篩選自日本明治酸奶)和ATCC 11842(購(gòu)于北納生物有限公司，分離自保加利亞酸奶)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AW500SG厭氧工作站,英國(guó)依萊泰科公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器GR60DA,廈門(mén)致微儀器有限公司；蒸汽滅菌鍋 SX-300,日本Tomy；分析天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司；HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH計(jì)ST3100,常州奧豪斯儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16M、臺(tái)式高速離心機(jī)TG16A,上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX,賽默飛世爾科技有限公司；Waters 1525EF高效液相色譜儀,美國(guó)沃特世公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

乳清蛋白培養(yǎng)基組成參考LIU等[1]的配方并進(jìn)行修改。每100 mL乳清蛋白培養(yǎng)基包含4.5 g乳糖、1 g WPI、0.024 g MgSO4、0.003 g MnSO4、0.001 g FeSO4、0.100 g吐溫80、20 μg對(duì)氨基苯甲酸和10 μg葉酸。用HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別至6.5、6.0、5.5和5.2后，用0.45 μm的無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾，分裝至5 mL滅菌試管后使用。

1.3.2 發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)及產(chǎn)酸速率的測(cè)定

接種后的發(fā)酵液置于40 ℃培養(yǎng)，于0、3、6、9及12 h取樣測(cè)定pH，并進(jìn)行10 倍稀釋至10-6，MRS平板計(jì)數(shù)。

1.3.3 無(wú)細(xì)胞提取液的制備

分別取發(fā)酵至0、3、6、9及12 h的樣品，4 000×g，4 ℃ 離心10 min，用50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)重懸并離心，重復(fù)3次后將菌體重懸于相同的緩沖液中至終體積為2 mL。采用液氮研磨的方法破碎細(xì)胞，將含有菌體的緩沖液振勻后置于研缽中，加入一定體積的液氮不斷研磨，反復(fù)凍融3次，之后收集研磨物，12 000×g，4 ℃離心10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4 氨肽酶活力的測(cè)定

根據(jù)STEFANOVIC等[12]的方法，將底物L(fēng)-Lys-pNA、H-Arg-pNA及H-Gly-Pro-pNA用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)制成1 mmol/L的溶液。96孔板每個(gè)孔中加入50 μL底物和50 μL無(wú)細(xì)胞提取液后，37 ℃孵育30 min，于405 nm處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。氨基酸肽酶的活性定義為:單位酶量每分鐘每毫克蛋白釋放對(duì)硝基苯胺的量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制不同濃度(5～300 μmol/L)的對(duì)硝基苯胺溶液，每個(gè)濃度取100 μL在 405 nm 測(cè)定吸光值，重復(fù)測(cè)定3次，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線?？瞻讓?duì)照用緩沖液代替CFE；蛋白含量用BCA試劑盒平行測(cè)定3次。

1.3.5 乳清蛋白利用情況的測(cè)定

參考朱鑫鑫等[13]的方法并進(jìn)行修改。采用反向液相色譜的方法對(duì)8株德式乳桿菌保加利亞亞種(以下簡(jiǎn)稱保加利亞乳桿菌)水解乳清蛋白主要成分的能力進(jìn)行分析。(1)樣品預(yù)處理:取0、3、6、9及12 h的發(fā)酵樣品，6 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，用0.45 μm的尼龍膜過(guò)濾。(2)色譜條件：以Xbridge Peptide BEH C18為色譜柱(300 A，3.5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.8 mL/min,柱溫30 ℃，洗脫時(shí)間22 min，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，采用梯度洗脫方式。洗脫梯度：0 min：體積分?jǐn)?shù)64%流動(dòng)相A；2 min：體積分?jǐn)?shù)64%流動(dòng)相A；7～17 min：體積分?jǐn)?shù)58%流動(dòng)相A；19 min：體積分?jǐn)?shù)64%流動(dòng)相A；19～22 min：體積分?jǐn)?shù)64%流動(dòng)相A。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)處理

本文中所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2017軟件繪圖，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳清蛋白培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)能力的影響

為了探討乳清蛋白培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株的生長(zhǎng)能力的影響，選擇已報(bào)道可利用乳清蛋白的Lb.2038分別在初始pH值為6.5、6.0、5.5和5.2四種體系中進(jìn)行發(fā)酵，比較不同條件下菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸速率的差異性(圖1)。

a-活菌數(shù);b-pH

菌株Lb.2038在不同初始pH的乳清培養(yǎng)基中展示出了差異顯著的生長(zhǎng)曲線，從MRS培養(yǎng)基體系接種到營(yíng)養(yǎng)限制型的乳清蛋白培養(yǎng)基后出現(xiàn)了一段時(shí)間的調(diào)整期，在0～6 h期間，4種條件下的活菌數(shù)均低于初始接種量。培養(yǎng)6 h后，在pH 6.0和pH 5.5條件下的菌株生長(zhǎng)速率優(yōu)于pH 6.5和pH 5.2，12 h后，在pH 6.0和pH 5.5體系下的菌株生長(zhǎng)量接近于初始接種量，pH 5.2體系下的活菌數(shù)低于初始接種量，而在pH 6.5的培養(yǎng)條件下活菌數(shù)持續(xù)下降。與本文研究結(jié)果一致，LIU等[14]在相似的乳清蛋白培養(yǎng)基中的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，初始pH 5.5時(shí)菌株Lb.2038的生長(zhǎng)速率較高。初始pH對(duì)菌株在乳清蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響可能與乳清蛋白的構(gòu)象有關(guān)。根據(jù)SCAR等[15]的研究結(jié)果，當(dāng)乳清蛋白的pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白分子間靜電排斥力減弱，會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)降低，表面疏水性增大，—CO與NH—之間的氫鍵被破壞，因此在初始pH 5.5時(shí)，菌株對(duì)蛋白的水解程度增大，從而有效水解蛋白以維持自身的生長(zhǎng)繁殖，表現(xiàn)出比其他3種初始pH值更高的生長(zhǎng)量。

初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)乳酸能力也有影響。在pH 6.5的培養(yǎng)條件下，菌株在0～3 h內(nèi)迅速產(chǎn)酸，之后隨著活菌數(shù)的下降產(chǎn)酸幾乎停滯。在其他3種初始pH值的培養(yǎng)條件下，各菌株的產(chǎn)酸速率大致相仿，初始pH值為6.0時(shí)的產(chǎn)酸速率略快于初始pH值為5.5和5.2時(shí)的產(chǎn)酸速率。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用初始pH為5.5的乳清蛋白培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行活化與發(fā)酵。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中不同菌株的生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酸速率

8株保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。

a-活菌數(shù);b-OD600

在乳清蛋白培養(yǎng)基中，8株保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期均在0～3 h內(nèi)、3～6 h之后緩慢生長(zhǎng)至穩(wěn)定期，而在MRS培養(yǎng)基[16]或脫脂乳[17]中保加利亞乳桿菌則會(huì)經(jīng)歷4 h的延滯期。這一結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌在經(jīng)過(guò)同體系活化后，能夠快速利用乳清蛋白。其中，生長(zhǎng)量最高的是菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2，12 h時(shí)活菌數(shù)分別達(dá)到7.50和7.53 lg CFU/mL，而生長(zhǎng)量最低的是菌株DXJSLMS1M5和ATCC 11842,12 h時(shí)活菌數(shù)分別為7.44和7.43 lg CFU/mL。但可能由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及單一氮源的限制，12 h內(nèi)8株菌的活菌數(shù)增量?jī)H為0.6～0.7個(gè)數(shù)量級(jí)，且菌株間無(wú)顯著性差異。OD600測(cè)定值表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)情況，菌株在3 h內(nèi)即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，9 h后到達(dá)穩(wěn)定期。其中，生長(zhǎng)速率最快的是DQHXNS8L6和DQHXNS15M2，ΔOD600分別為1.14±0.02和1.17±0.02，而菌株2038僅為0.98±0.03。營(yíng)養(yǎng)成分不同的乳清蛋白對(duì)于菌株的生長(zhǎng)能力具有較大影響，PESCUMA等[19]利用含10%蛋白、76.5%乳糖及0.45%鈉鹽的重組乳清蛋白粉對(duì)64株乳酸菌的生長(zhǎng)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，81%的菌株活菌數(shù)增量在6 h內(nèi)時(shí)大于1個(gè)數(shù)量級(jí)，而LIU等[14]利用牛奶中沉淀酪蛋白后的乳清蛋白發(fā)酵德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌4 h后，菌株的生長(zhǎng)量與本文一致。

8株保加利亞乳桿菌的pH變化曲線如圖3所示。其中，pH變化最快的是菌株D11M188和DQHXNS15M2，12 h分別達(dá)到0.84±0.08和0.77±0.07，pH下降最慢的是菌株ATCC 11842，12 h pH僅下降0.56±0.12，且其生長(zhǎng)能力也較差。相比于在氮源豐富的脫脂乳中部分保加利亞乳桿菌能夠在6 h內(nèi)pH從6.5下降至5.2～4.7[19]，在乳清蛋白體系中，所有菌株均表現(xiàn)出較低的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸能力。但這一結(jié)果仍然表明，保加利亞乳桿菌可以僅利用乳清蛋白進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，這與LIU等[1]的結(jié)論一致。

圖3 德式乳桿菌保加利亞亞在乳清蛋白培養(yǎng)基中的pH變化

2.3 發(fā)酵過(guò)程中不同菌株的3種氨肽酶活力

為了評(píng)估8株保加利亞乳桿菌在乳清蛋白培養(yǎng)基發(fā)酵過(guò)程中的氨肽酶(PepN、PepX、PepC)活力，分別使用含L-Lys-pNA、H-Arg-pNA和H-Gly-Pro-pNA的顯色底物測(cè)定保加利亞乳桿菌氨肽酶PepN、PepC和PepX的酶活力水平，結(jié)果如圖4所示。

a-PepN;b-PepC;c-PepX

從圖4可以看出，在12 h的發(fā)酵過(guò)程中，8株保加利亞乳桿菌對(duì)3種不同肽酶底物的酶活力和變化趨勢(shì)顯示出顯著差異(圖4)。在3 h時(shí)菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2具有最高的3種氨肽酶活力，而其余菌株由于生長(zhǎng)速率相對(duì)緩慢，此時(shí)仍未表現(xiàn)出氨肽酶活性，6 h之后8株菌均具有3種氨肽酶活力且大部分菌株在6 h時(shí)3種氨肽酶活力最高。菌株的PepN和PepC酶活力變化趨勢(shì)相似，大部分菌株都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，而8株保加利亞乳桿菌的PepX酶活力普遍低于PepN和PepC，且不同菌株的變化趨勢(shì)差異較大。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，達(dá)到最高PepN酶活力的是菌株DSCAB10M20和D11M188，其PepN酶活力范圍分別為從0～13.49和13.00 nmol 對(duì)硝基苯胺/(min·mg蛋白)；達(dá)到最高PepC酶活力的是菌株Lb.2038，其PepC酶活力范圍從0～17.17 nmol對(duì)硝基苯胺/(min·mg蛋白)；菌株DQHXNS8L6在3 h表現(xiàn)出18.81 nmol對(duì)硝基苯胺/(min·mg蛋白)的PepX酶活力，顯著高于其他菌株。比較3種不同的氨肽酶活力，發(fā)現(xiàn)除菌株DQHXNS8L6對(duì)PepX表現(xiàn)出最高的酶活力外，其余菌株的3種氨肽酶最高活力基本表現(xiàn)為PepC>PepN>PepX，這與MARIE等[5]對(duì)瑞士乳桿菌在MRS和脫脂乳培養(yǎng)基的研究結(jié)果一致，研究表明菌株對(duì)不同底物的酶活力表現(xiàn)為L(zhǎng)-Arg-pNA>H-Lys-pNA>H-Gly-Pro-pNA。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中不同菌株的乳清蛋白組分消耗率分析

如圖5所示，8株保加利亞乳桿菌對(duì)于乳清蛋白中的4種主要成分具有不同的水解能力。其中，8株菌株對(duì)BSA和α-La的水解能力無(wú)明顯差異(圖5)，而8株菌株對(duì)于β-Lg的利用能力具有顯著的菌株差異性。8菌株對(duì)于α-La均具有較強(qiáng)的水解能力，消耗量范圍為26.93%～31.33%，但菌株間無(wú)顯著性差異。值得注意的是，8株保加利亞乳桿菌對(duì)β-Lg的變異體[20]β-LgA和β-LgB的消耗量范圍分別為10.56%～22.82%和9.04%～23.83%。從3 h起，菌株DQHXNS8L6、DQHXNS15M2和DQHXNS1L2對(duì)于β-LgA的利用能力就顯著高于其他菌株。對(duì)于β-LgB，菌株DQHXNS8L6、DQHXNS15M2同樣在3 h就表現(xiàn)出較強(qiáng)的水解能力，而菌株ATCC 11842對(duì)于β-LgA和β-LgB的水解能力均較弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分保加利亞乳桿菌具有潛在發(fā)酵乳清蛋白的能力。與本文研究結(jié)果一致，PESCUMA等[21]發(fā)現(xiàn)部分菌株具有更強(qiáng)的蛋白水解能力，他們使用3種不同的乳酸菌水解補(bǔ)充濃縮乳清蛋白的CDM培養(yǎng)基時(shí)發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌CRL 454比其他菌株更大程度地降解α-La和β-Lg(分別為26%和21%)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，8株保加利亞乳桿菌對(duì)α-La的水解能力相似，而對(duì)β-Lg的水解能力表現(xiàn)出較大的菌株差異性，同時(shí)菌株對(duì)β-Lg的水解能力與氨肽酶PepN、PepC和PepX酶活力之間存在相關(guān)性，在發(fā)酵過(guò)程前期表現(xiàn)出高氨肽酶活力的菌株對(duì)于β-Lg的2種變異體均有較高的水解能力。由于3種氨肽酶底物分別為L(zhǎng)-Lys-pNA、H-Arg-pNA和H-Gly-Pro-pNA，α-La序列由146個(gè)氨基酸組成，其中PepN和PepC對(duì)應(yīng)的Lys和Arg切割位點(diǎn)分別有12個(gè)和1個(gè)，PepX對(duì)應(yīng)的X-Pro位點(diǎn)共2個(gè)；β-Lg及其前體肽序列由182個(gè)氨基酸組成，其中PepN和PepC對(duì)應(yīng)的Lys和Arg切割位點(diǎn)分別有16個(gè)和3個(gè)，PepX對(duì)應(yīng)的X-Pro位點(diǎn)共8個(gè)，β-Lg含有的3種氨肽酶對(duì)應(yīng)的切割位點(diǎn)均多于α-La，而B(niǎo)SA雖然含有較多的3種底物酶切位點(diǎn)，但其在WPI中的含量(3.38%)遠(yuǎn)低于β-Lg和α-La，因此PepN、PepC和PepX的酶活力更能反映出β-Lg的水解情況。然而，蛋白水解體系是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，除了氨肽酶活力外，一方面菌株的胞壁酶活力和多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)菌株的蛋白水解能力具有重要影響[22-23]；另一方面乳清蛋白本身的特性及變性程度也會(huì)影響菌株的蛋白利用能力[24]，因此要深入研究保加利亞乳桿菌對(duì)于乳清蛋白利用能力的機(jī)制仍需結(jié)合多方面因素進(jìn)一步分析。

a-BSA消耗量;b-α-La消耗量;c-β-LgA消耗量;d-β-LgB消耗量;e-菌株DQHXNS15M2和ATCC 11842蛋白消耗量峰面積對(duì)比圖

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,德式乳桿菌保加利亞亞種在乳清蛋白培養(yǎng)基中最適宜菌株生長(zhǎng)的初始pH值是5.5，在該體系中,德式乳桿菌保加利亞亞種能夠在3 h內(nèi)快速生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期。菌株的3種氨肽酶活力(PepN、PepC、PepX)在發(fā)酵12 h過(guò)程中均表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，但不同菌株之間的氨肽酶活力也存在顯著差異性。不同德式乳桿菌保加利亞亞種對(duì)于乳清蛋白組分BSA和α-La的水解能力基本相同，但對(duì)于β-Lg的水解能力存在明顯的菌株差異性，β-乳球蛋白的變異體A和B的水解范圍分別是10.56%～22.82%和9.04%～23.83%。此外，菌株的氨肽酶活力與β-Lg水解能力之間存在一定相關(guān)性，菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2在3 h即能達(dá)到最高的氨肽酶活力并較大程度地水解β-Lg，而其余菌株在6 h時(shí)表現(xiàn)出發(fā)酵過(guò)程中的最高酶活力，這類(lèi)菌株對(duì)于β-Lg的水解能力也相對(duì)較弱。

本文基于德式乳桿菌保加利亞亞種在乳清蛋白培養(yǎng)體系的氨肽酶活力及蛋白利用能力進(jìn)行分析，可篩選出具有較高氨肽酶活力并具有良好α-La和β-Lg利用能力的菌株，對(duì)發(fā)酵乳清蛋白飲料的研究具有一定價(jià)值，但尚需對(duì)于不同菌株水解乳清蛋白后的產(chǎn)物分析進(jìn)行進(jìn)一步研究。