劉孝芳，遲珺曦，雷文平,2，劉成國(guó),2*

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙,410128) 2(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué))，湖南 長(zhǎng)沙,410128)

在日常膳食中，人們會(huì)因過(guò)量攝入食物而導(dǎo)致血清中膽固醇含量異常，進(jìn)而增大心腦血管疾病的患病率[1]。乳酸菌具有降膽固醇的功能特性[2-4]，其中乳酸菌所產(chǎn)的膽鹽水解酶(bile salt hydrolase, BSH)在降解機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]。BSH能水解胃腸道中的結(jié)合態(tài)膽鹽(甘氨膽酸鹽)，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離態(tài)膽酸，游離態(tài)膽酸能與膽固醇共同沉淀，以糞便的形式排出體外，從而降低血清中的膽固醇含量[6]。此現(xiàn)象亦稱“共沉淀現(xiàn)象”[7]，是目前較認(rèn)可的降解機(jī)制[8-9]。

本試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)BSH的乳酸菌進(jìn)行篩選與鑒定，以BSH酶解甘膽酸鈉后的甘氨酸生成量作為BSH活性判定指標(biāo)，旨在研究產(chǎn)BSH的乳酸菌在不同條件下產(chǎn)BSH酶的活性及氨基酸生成量的變化規(guī)律，為進(jìn)一步優(yōu)化BSH水解反應(yīng)條件和深入探討乳酸菌降解膽固醇機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶，湖南省畜牧場(chǎng)牛奶貯藏罐；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumWCFS1)，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.1 試劑

MRS肉湯固(液)體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；牛膽酸鈉，北京索萊寶科技有限公司；甘膽酸鈉，上海麥克林生化科技有限公司；脫脂奶粉，澳優(yōu)乳業(yè)股份有限公司；CaCO3、NaOH、HCl、NaCl、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉、甘油、茚三酮、乙醇、甘氨酸、三氯乙酸(分析純?cè)噭?，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染色液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

茚三酮顯色液：12.5 mL 10 g/L茚三酮檸檬酸溶液(稱取0.5 g茚三酮溶解于50 mL pH 5 0.5 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中)+32.5 mL體積分?jǐn)?shù)30%甘油+5 mL 0.5 mol/L檸檬酸鹽緩沖液

1.2 儀器與設(shè)備

HX-20G恒溫金屬浴鍋，上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司；HH-601超級(jí)恒溫水浴，常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司；Bante920 pH計(jì)，上海般特儀器制造有限公司；XW-80A漩渦混勻儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；BH-2光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

取25 mL牛奶置于盛有225 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中(瓶中預(yù)置適量的無(wú)菌玻璃珠)，充分混勻得10-1的樣品勻液，再稀釋成10-2、10-3、10-4的樣品。分別吸取稀釋液0.1 mL于含10 g/L CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基平板上，涂布分離，37 ℃下培養(yǎng)24～48 h[10]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸可溶解CaCO3，在培養(yǎng)基上形成透明的溶鈣圈[11]，挑取有明顯溶鈣圈，且革蘭氏染色為陽(yáng)性的菌落，于MRS固體培養(yǎng)基上3代劃線純化后，編號(hào)并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)膽鹽水解酶菌株的篩選

依據(jù)乳酸菌降膽固醇的機(jī)理[7]：乳酸菌產(chǎn)生的BSH使膽鹽共軛活性增強(qiáng)，將結(jié)合態(tài)膽鹽水解為游離態(tài)膽酸，游離態(tài)膽酸與膽固醇共同沉淀。若菌株能夠產(chǎn)BSH，則菌落在含膽鹽培養(yǎng)基中形成乳白色沉淀圈。

將分離純化得到的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化2代，參照王玉文等[12]的牛津杯法將菌懸液接種至含3 g/L?；悄扄}的MRS固體培養(yǎng)基上，接種量為0.15 mL，37 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)乳白色沉淀圈。挑取沉淀，于蒸餾水中完全溶解，旋渦振蕩后滴加茚三酮顯色液，溶液變藍(lán)紫色則初步確認(rèn)存在膽鹽水解酶[13]。

植物乳桿菌WCFS1含4個(gè)膽鹽水解酶活性基因[14]，具有高膽鹽水解酶活性，因此以WCFS1作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，在篩選及不同條件下BSH的活性測(cè)定的試驗(yàn)中作參比對(duì)照。

1.3.3 菌株N1、N12的細(xì)胞形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定

對(duì)N1和N12進(jìn)行革蘭氏染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。參照吳詩(shī)敏等[15]的分子生物學(xué)鑒定方法，將液體培養(yǎng)基中的菌株純化得到PCR產(chǎn)物，隨即送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 不同條件下膽鹽水解酶的活性測(cè)定

BSH是一類由腸道微生物合成的胞內(nèi)酶，能水解結(jié)合型膽鹽從而增強(qiáng)菌體對(duì)膽鹽毒性的抵御能力，延長(zhǎng)菌體在腸道中的生存時(shí)間[16]。BSH特異性識(shí)別底物甘膽酸鈉，將其水解生成甘氨酸，試驗(yàn)中以測(cè)定甘氨酸的生成量為判定BSH水解活性的指標(biāo)。甘氨酸與茚三酮作用生成藍(lán)紫色物質(zhì)[17]，記錄其在570 nm處的吸光值。

1.3.4.1 酶活力的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照姜金康[18]測(cè)定酶活力的部分方法作修改。將培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液、空白組加入體積分?jǐn)?shù)15%三氯乙酸，添加量為體積分?jǐn)?shù)為30%，混勻靜置15 min，8 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液，加入0.5 mL茚三酮顯色液，旋渦振蕩，密封沸水浴15 min，迅速冰浴3 min，再加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，混勻靜置5 min后測(cè)定在570 nm處的吸光度。

配制1 mmol/L甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取上述溶液0、200、400、600、800、1 000 μL至離心管中，用蒸餾水補(bǔ)足體積為1 mL，再分別加入0.5 mL顯色液，旋渦振蕩后密封沸水浴15 min，迅速冰浴冷卻3 min，加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇混勻，靜置5 min，在570 nm下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 pH對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

制備7組不同pH的脫脂牛奶培養(yǎng)基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將每組培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于上述培養(yǎng)基中。每組設(shè)置空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定膽鹽水解酶的活性。

1.3.4.3 紫外照射時(shí)間對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于脫脂牛奶培養(yǎng)基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的體積分?jǐn)?shù)12%脫脂牛奶)中，并分為7組。紫外光(30 W)照射上述培養(yǎng)基0、5、10、15、20、25、30 min，每組設(shè)置空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定膽鹽水解酶活性。

1.3.4.4 溫度對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

活化2代后的N1、N12、WCFS1以10%接種于脫脂牛奶培養(yǎng)基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)中，制備5組實(shí)驗(yàn)組于26、37、48、59、70℃下處理30 min，每組設(shè)置空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定膽鹽水解酶活性。

1.3.4.5 糖濃度對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

制備7組不同葡萄糖濃度的脫脂牛奶培養(yǎng)基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)，葡萄糖添加量為：1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%。N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于以上7組中。每組設(shè)置空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定膽鹽水解酶活性。

1.3.4.6 鹽濃度膽鹽水解酶活性的影響

制備7組脫脂牛奶培養(yǎng)基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)，NaCl添加量為：1%、4%、7%、10%、13%、16%、19%，N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于上述培養(yǎng)基中。每組設(shè)置空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定膽鹽水解酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離與純化的結(jié)果

從湖南省畜牧場(chǎng)牛奶中分離得到27株乳酸菌，分離純化后按照挑選順序編號(hào)為N1～N27，用40%甘油于-20 ℃冷凍保藏。

2.2 產(chǎn)膽鹽水解酶菌株的篩選

27株乳酸菌中僅有2株產(chǎn)BSH，為菌株N1和N12。圖1是3株菌(包含陽(yáng)性對(duì)照菌WCFS1)在含?；悄扄}的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的乳白色沉淀圈，且3株菌刮下的沉淀溶于蒸餾水后滴加茚三酮顯色劑，均呈藍(lán)紫色。

圖1 沉淀圈現(xiàn)象

2.3 菌株N1、N12的細(xì)胞形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，菌株N1、N12細(xì)胞均成桿狀或圓柱形，菌體有平直狀、彎曲狀，細(xì)胞兩端呈弧狀，單生、成對(duì)、成鏈排列，無(wú)芽孢，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性。因此，初步判定2株菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)。

圖2 菌株N1和N12的細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)測(cè)序獲得菌株N1、N12的16S rRNA 基因序列，基因序列大小分別為1 449、1 437 bp。測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST序列對(duì)比后，構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示。N1、N12與L.plantarumMG5204、L.plantarumTSGB1272聚于一支。因此，菌株N1和N12為植物乳桿菌(L.plantarum)，結(jié)合菌株細(xì)胞形態(tài)的觀察而進(jìn)一步確認(rèn)2株菌均為植物乳桿菌(L.plantarum)。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株N1和N12的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 不同條件下膽鹽水解酶的活性測(cè)定

2.4.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

甘氨酸含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.685 5x-0.497 5，R2=0.999 2，其中x代表甘氨酸濃度，y代表在570 nm下的吸光值。

2.4.2 pH對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

為了探究pH對(duì)BSH活性影響，本試驗(yàn)對(duì)N1和N12的BSH酶解后的生成物含量(甘氨酸)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)酶活性的影響

3株菌(N1、N12和WCFS1)培養(yǎng)上清液中的甘氨酸含量隨著pH值的上升，先增加后減少，則膽鹽水解酶的活性隨pH值的增加呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì)。N1、N12和WCFS1的酶活性變化趨勢(shì)符合，均在pH為7.0時(shí)，其酶活性最強(qiáng)，當(dāng)pH超過(guò)7.0時(shí)，酶活性受到抑制作用。同時(shí)，pH對(duì)膽鹽水解酶活性有極顯著影響(P<0.01)，分析以上現(xiàn)象，在培養(yǎng)環(huán)境過(guò)酸、過(guò)堿時(shí)，會(huì)導(dǎo)致BSH化學(xué)變性而引起空間結(jié)構(gòu)的改變，可能影響與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致水解效率降低。

2.4.3 紫外照射時(shí)間對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

菌株經(jīng)不同紫外照射時(shí)間處理后的BSH活性變化趨勢(shì)如圖5所示。

圖5 紫外照射時(shí)間對(duì)酶活性影響

紫外照射時(shí)間與上清液甘氨酸濃度不成線性關(guān)系，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，甘氨酸濃度波動(dòng)無(wú)規(guī)律。N12與WCFS1經(jīng)一定時(shí)間的紫外照射后，其水解生成的甘氨酸濃度較低，均低于在相同處理?xiàng)l件下N1的甘氨酸生成量，因此猜測(cè)N1菌株對(duì)紫外的耐性比N12、WCFS1強(qiáng)。由此現(xiàn)象可知，3株菌在紫外照射30 min內(nèi)，其酶活性紊亂不定，水解生成的甘氨酸濃度呈波動(dòng)變化，無(wú)法判斷此條件對(duì)酶活力是否產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用或抑制作用。

2.4.4 溫度對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

菌株經(jīng)不同溫度處理后的BSH活性變化趨勢(shì)如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)酶活性影響

N1、N12和WCFS1的酶活性隨短時(shí)溫度處理的度數(shù)增加，呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，3株菌均在59 ℃下處理30 min后，其水解生成的甘氨酸濃度最大，膽鹽水解酶活性最強(qiáng)，耐熱性能良好，但在70 ℃下處理30 min后，菌種幾乎失活無(wú)法經(jīng)過(guò)后期培養(yǎng)產(chǎn)生膽鹽水解酶，且結(jié)果顯示溫度處理對(duì)膽鹽水解酶活性有極顯著影響(P<0.01)。此項(xiàng)試驗(yàn)意在探究短時(shí)溫度處理能否起到激活酶活性的作用，分析此現(xiàn)象，菌種均在試驗(yàn)溫度下處理30 min后于37 ℃培養(yǎng)24 h，并未在試驗(yàn)溫度下直接培養(yǎng)24 h，因此猜測(cè)酶的空間結(jié)構(gòu)并未全部破壞，短時(shí)間的高熱處理，甚至可能使酶在保證原有活性的基礎(chǔ)上暴露更多的酶活性位點(diǎn)，以提高酶水解能力。

2.4.5 葡萄糖濃度對(duì)膽鹽水解酶活性的影響

菌株在不同糖濃度環(huán)境下培養(yǎng)后，其BSH活性變化趨勢(shì)如圖7所示。

圖7 葡萄糖添加量對(duì)酶活性影響

葡萄糖作為培養(yǎng)基中的重要碳源，碳源直接影響菌體的生長(zhǎng)與代謝及水解酶的合成與作用。添加量過(guò)少，菌體生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致水解酶合成量受限，添加量過(guò)多產(chǎn)生阻遏作用，抑制水解酶的合成。結(jié)果顯示，隨葡萄糖濃度的逐增，3株菌生成的甘氨酸先增后減，N12在葡萄糖重量百分比濃度為5%時(shí)，酶活性已達(dá)峰值，而N1與WCFS1峰值在濃度增至10%才出現(xiàn)峰值，N12糖濃度的耐受力弱于N1。當(dāng)濃度由10%增至15%時(shí)，酶活性驟減，此后再增大糖濃度對(duì)酶活性的影響甚微。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖添加量對(duì)BSH活性有極顯著影響(P<0.01)，其葡萄糖質(zhì)量百分比濃度在5～10%范圍內(nèi)，BSH持有較高酶活力。

2.4.6 NaCl濃度膽鹽水解酶活性的影響

菌株在不同鹽濃度環(huán)境下培養(yǎng)后，其BSH活性變化趨勢(shì)如圖8所示。

圖8 NaCl添加量對(duì)酶活性影響

NaCl可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，在等滲環(huán)境下菌株正常生長(zhǎng)，高滲環(huán)境下菌株失水抑制其生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，甘氨酸濃度隨NaCl量的增加呈先增后減的趨勢(shì)。N12在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，酶活力最強(qiáng)，此后活力驟減再趨于平穩(wěn)，N1的耐鹽能力強(qiáng)于N12，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至7%時(shí)，酶活力最強(qiáng)，NaCl質(zhì)量在7%～13%，酶活性驟減。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，鹽添加量對(duì)BSH活性有極顯著影響(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

本研究從生鮮牛奶中共計(jì)分離乳酸菌27株，其中產(chǎn)膽鹽水解酶的乳酸菌共計(jì)2株，分別為N1、N12。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)，N1與N12被鑒定為植物乳桿菌(L.plantaruma)。N1、N12與植物乳桿菌Lp529[18]的BSH活性相比，后者較強(qiáng)，但N1、N12的BSH活性又強(qiáng)于植物乳桿菌KLDS6.0330[19]。

根據(jù)單因素多水平試驗(yàn)，0～30 min的紫外照射處理對(duì)BSH活性影響甚微，不構(gòu)成變化規(guī)律。但pH、溫度、糖鹽添加量對(duì)BSH活性有極顯著影響，從而確定了N1、N12保持BSH高活性的最適pH為7，最適溫度為59 ℃。其中N1的最適糖添加量為10%，最適鹽添加量7%。N12對(duì)糖、鹽的耐受力不及N1，其最適糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%，最適鹽質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%。這與李婷婷等[20]研究的屎腸球菌90-1的膽鹽水解酶的最適反應(yīng)溫度(37 ℃)與最適反應(yīng)pH(6.0)均不一致，可能因?yàn)槔铈面玫脑囼?yàn)中僅僅在單因素條件下處理30 min，并未繼續(xù)培養(yǎng)24 h，導(dǎo)致出現(xiàn)的菌種水解活性差異性較大，以及菌種之間的差異性導(dǎo)致結(jié)果不同。惠明等[21]研究發(fā)現(xiàn)BSH活性與還原糖的消耗速率有關(guān)，酶活性與消耗速率呈正相關(guān)，因此本試驗(yàn)中確定了菌株N1、N12最適的糖質(zhì)量百分比濃度。要將此類乳酸菌開(kāi)發(fā)應(yīng)用于食品工業(yè)中并發(fā)揮良好降解膽固醇能力，食鹽乃為食品工藝中最重要的調(diào)味品，其添加量過(guò)大對(duì)乳酸菌的抑制明顯[22]，添加量過(guò)小影響食品風(fēng)味與質(zhì)構(gòu)，因此確定了N1、N12的最佳鹽質(zhì)量百分比濃度，為后續(xù)的投入生產(chǎn)提供可靠的理論基礎(chǔ)。不同的培養(yǎng)條件對(duì)乳酸菌降解膽固醇的效率影響顯著[23]，對(duì)菌株N1和N12的培養(yǎng)條件等進(jìn)行深入研究，為2株菌后續(xù)應(yīng)用工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。