簡東振,周志磊,鞏敏,蔣彰,朱勝虎,李信,韓笑,聶旭東,毛健,5*
1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)4(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司,江蘇 鎮(zhèn)江,212043) 5(國家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江 紹興,31200)
鎮(zhèn)江香醋以其“色、香、酸、醇、濃”等特點(diǎn),深受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。陳釀是食醋生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟,直接影響其風(fēng)味物質(zhì)的改變。鎮(zhèn)江香醋通常會放置在有陽光、通風(fēng)好的地方,經(jīng)陶壇密封陳釀,在陳釀過程中受貯存環(huán)境的影響,發(fā)生一系列的物理化學(xué)變化,其風(fēng)味特征也會產(chǎn)生不同程度的改變[1-4]。并且,國外發(fā)酵食品的研究中也明確了溫度、氧氣等環(huán)境因素對風(fēng)味品質(zhì)有明顯的影響[5-6]。
在陳釀過程中溫度和氧氣是影響食醋風(fēng)味品質(zhì)的2個重要因素,然而,目前對于鎮(zhèn)江香醋陳釀風(fēng)味特征的研究中,關(guān)于貯存環(huán)境影響的研究較少。因此,本實(shí)驗(yàn)通過對食醋的模擬陳釀,采用固相萃取(solid-phase extraction, SPE)和頂空-頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)對不同溫度和氧氣條件下食醋樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測,并通過主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析方法[7-8]進(jìn)行綜合分析,明確溫度和氧氣對風(fēng)味物質(zhì)的影響。
食醋樣品:由鎮(zhèn)江恒順醋業(yè)有限公司提供。
主要試劑:香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純),百靈威試劑公司;C5-C30正構(gòu)烷烴,Sigma-Aldrich(中國上海)公司;LiChrolutEN固相萃取小柱,德國Merck公司。
恒溫培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Thermo Fisher TRACE 1300氣相色譜儀,配有 ISQ 質(zhì)譜檢測器,美國賽默飛世爾科技有限公司;2cm 50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國Supelco公司;DF-101KS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州恒巖儀器有限公司;氮吹儀,上海安譜公司。
1.3.1 模擬陳釀處理方法
溫度影響:采用預(yù)先滅菌處理的50 mL樣品瓶作為貯存容器,裝樣量35 mL。分別取15個食醋樣品放置在25、40和55 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,模擬陳釀5個月。所有樣品不進(jìn)行充氧操作,每組3個平行。
氧氣影響:食醋樣品在超凈工作臺中溫和充氧30 s,使樣品瓶剩余空間盡可能全部充滿氧氣,充氧方式是采用氧氣罐,通過減壓閥減壓充氧。充氧處理共分3組:不充氧、每月充氧和半月充氧,每組15個食醋樣品,全部放置在40 ℃條件下。每隔1個月進(jìn)行取樣檢測分析。
1.3.2 預(yù)處理方法
SPE:根據(jù)文獻(xiàn)[9]的報道方法略加改動。將食醋樣品用超純水稀釋5倍,分別取10 mL稀釋樣品加入20 μL內(nèi)標(biāo)(4-甲基-2-戊醇乙醇溶液4.536 g/L),過0.22 μm水系膜,樣品通過LiChrolut-EN SPE小柱(小柱預(yù)先活化:5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇和5 mL超純水依次淋洗)后用5 mL超純水沖洗小柱,減壓干燥后使用10 mL二氯甲烷萃取洗脫,無水Na2SO4干燥,最后有機(jī)相通過氮吹濃縮至1 mL。
HS-SPME:根據(jù)文獻(xiàn)[10]的報道方法略加改動。取5 mL醋樣,2 g NaCl以及50 μL內(nèi)標(biāo)(4-甲基-2-戊醇乙醇溶液0.453 6 g/L)加入到15 mL頂空瓶中,密封在60 ℃的恒溫水浴鍋中加熱(平衡10 min,吸附40 min)。
1.3.3 儀器分析方法
GC條件:DB-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣;升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min,以4 ℃/min升溫至240 ℃保持10 min;載氣為氦氣(>99.999%),流速1.0 mL/min。
MS條件:電離方式EI;傳輸線溫度和離子源溫度分別為240、280 ℃;質(zhì)量數(shù)掃描范圍33~350 amu。
此外,采用SPE前處理方法,溶劑延遲時間4.5 min,進(jìn)樣量1 μL;采用HS-SPME前處理方法,進(jìn)樣口250 ℃下解析6 min。
1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
SPE-GC-MS:準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的各香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加入到二氯甲烷溶液中配置得到一系列不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS分析,根據(jù)目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的濃度及響應(yīng)比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
HS-SPME-GC-MS:將食醋中的還原糖和氨基酸的含量按照一定比例配制食醋模擬液,還原糖以葡萄糖計[11-12]。將含有不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品的食醋模擬液進(jìn)行GC-MS分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.5 定性定量分析
揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性基于質(zhì)譜鑒定、香氣物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間比對和保留指數(shù)與文獻(xiàn)中保留指數(shù)比對。采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量。
采用Microsoft Office Excel 2016、Origin Pro 9.0、GraphPad Prism 8.0、R 3.5.2以及SIMCA 14.1軟件等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
在食醋樣品中共鑒定了66種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括酸類、醇類、酯類、醛酮類、酚類、含硫類以及雜環(huán)類化合物。由圖1可知,溫度和氧氣對風(fēng)味物質(zhì)有明顯的影響,大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)同時受溫度和氧氣的作用,溫度越高,溶氧量越大(半月充氧),其含量變化越明顯。
A-溫度;B-氧氣;1M-1個月;5M-5個月
2.1.1 溫度對鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響
圖2表明,溫度對酸類和醇類總量的影響較小,而酯類和醛類物質(zhì)總量受溫度影響較顯著,溫度由25 ℃升高到40 ℃,酯類物質(zhì)總量明顯減少,這可能是由于高溫加速酯類物質(zhì)的水解。而高溫對醛類物質(zhì)生成有促進(jìn)作用,可能與美拉德反應(yīng)和醇類物質(zhì)的氧化有關(guān)[13]。此外,溫度對酮類和雜環(huán)類物質(zhì)的總量影響較大(未顯示),隨著溫度的升高,酮類物質(zhì)總量有明顯的降低,而雜環(huán)類物質(zhì)總量顯著增加,雜環(huán)類物質(zhì)主要是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生,溫度有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行[14]。
A-酸類;B-醇類;C-酯類;D-醛類
隨著溫度的升高,短鏈脂肪酸如丙酸、丁酸、異丁酸等含量增加,而中長鏈脂肪酸如己酸、辛酸等趨于降低,在葡萄酒研究中也有類似結(jié)論[15]。苯乙醇、乙酸乙酯、異丁醛和異戊醛等在高溫條件下含量明顯高于低溫條件下的含量,說明溫度對它們的生成有促進(jìn)作用。3-羥基-2-丁酮是含量最高的風(fēng)味物質(zhì),受溫度影響顯著(圖3-A)。圖3-B表明,高溫能明顯促進(jìn)愈創(chuàng)木酚的生成。吡嗪類物質(zhì)廣泛存在于加熱的食品飲料中,如咖啡[16],白酒[17]等。2,3,5,6-四甲基吡嗪受溫度影響較大(圖3-C),溫度升高能促進(jìn)其含量增加,在食醋中3-羥基-2-丁酮和銨鹽通常被認(rèn)為是2,3,5,6-四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[18]。葫蘆巴內(nèi)酯,具有“焦糖香”的香氣特征,被認(rèn)為是多種酒精飲料的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[19-20],在食醋中首次被檢測定量,高溫有利于葫蘆巴內(nèi)酯的產(chǎn)生(圖3-D)。
A-3-羥基-2-丁酮;B-愈創(chuàng)木酚;C-2,3,5,6-四甲基吡嗪;D-葫蘆巴內(nèi)酯
2.1.2 氧氣對鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響
鎮(zhèn)江香醋在陳釀過程中受氧氣因素的影響,半月充氧是加大充氧頻率,增加樣品中溶解氧含量,進(jìn)而增強(qiáng)氧氣影響效果。如圖4所示,氧氣促進(jìn)酸類和醛類物質(zhì)總量的增加,而醇類和酯類物質(zhì)總量受影響較小。此外,雜環(huán)類物質(zhì)總量隨溶氧量的增大而增加,而含硫類物質(zhì)總量變化相反。含硫化合物可以通過美拉德反應(yīng)中含硫氨基酸的Strecker降解或微生物發(fā)酵產(chǎn)生[21],具有極低的香氣閾值和獨(dú)特的香氣特征,在食醋中也被鑒定為重要的香氣類別[22]。
A-酸類;B-醇類;C-酯類;D-醛類
由圖5可知,氧氣促進(jìn)2,3-丁二酮的生成,由于其香氣特征突出,2,3-丁二酮被鑒定為食醋中重要的香氣組分[23]。含硫化合物中,3-甲硫基丙醇隨著溶氧量的增加含量明顯減低。2,3,5,6-四甲基吡嗪以及葫蘆巴內(nèi)酯等不僅受溫度的影響,氧氣也是重要影響因素。此外,異丁醛和異戊醛是主要的兩種醛類物質(zhì),氧氣有利于它們的產(chǎn)生,在黃酒風(fēng)味特征的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)[4]。
A-2,3-丁二酮;B-3-甲硫基丙醇;C-2,3,5,6-四甲基吡嗪;D-葫蘆巴內(nèi)酯
2.2.1 基于PCA和OPLS-DA分析溫度對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響
對不同溫度條件下食醋樣品結(jié)果進(jìn)行PCA分析,提取3個主成分,累計貢獻(xiàn)率68.7%,基本可以代表樣品的整體信息。PCA結(jié)果表明(圖6-A),55 ℃與25、40 ℃條件下的樣品有明顯的區(qū)分。
A1-異戊醇;A2-苯甲醇;A3-苯乙醇;A4-2,3-丁二醇;B1-異丁醛;B2-異戊醛;B3-己醛;B4-苯甲醛;B5-苯乙醛;B6-香草醛;B7-丁香醛;C1-丁酸;C2-戊酸;C3-己酸;C4-辛酸;C5-異丁酸;C6-異戊酸;C7-苯甲酸;C8-丙酸;C9-壬酸;C10-糠酸;D1-乙酸乙酯;D2-乳酸乙酯;D3-丁二酸二乙酯;D4-乙酸苯乙酯;D5-異戊酸乙酯;D6-乙酸異戊酯;D7-己酸乙酯;D8-苯乙酸乙酯;D9-乙酸糠酯;D10-苯甲酸乙酯;D11-甲酸-2-苯乙酯;D12-煙酸乙酯;E1-2,3-丁二酮;E2-3-羥基-2-丁酮;E3-3-乙?;?2-丁酮;F1-愈創(chuàng)木酚;F2-苯酚;G1-二甲基二硫;G2-二甲基三硫;G3-3-甲硫基丙醛;G4-3-甲硫基丙醇;G5-3-甲硫基丙酸;H1-2,4,5-三甲基惡唑;H2-吡嗪;H3-2-甲基吡嗪;H4-2,5-二甲基吡嗪;H5-2,3-二甲基吡嗪;H6-2,3,5-三甲基吡嗪;H7-2,3,5,6-四甲基吡嗪,H8-糠醛;H9-2-乙酰基呋喃;H10-5-甲基糠醛;H11-r-丁內(nèi)酯;H12-糠醇;H13-r-己內(nèi)酯;H14-2(5H)-呋喃酮;H15-麥芽酚;H16-3-乙?;量?;H17-r-壬內(nèi)酯;H18-2-甲醛吡咯;H19-泛酰內(nèi)酯;H20-呋喃酮;H21-葫蘆巴內(nèi)脂;H22-5-乙酰氧基甲基-2-糠醛;H23-5-羥甲基糠醛
在55 ℃高溫長時間陳釀的食醋樣品附近,聚集的主要有2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪,葫蘆巴內(nèi)酯、5-羥甲基糠醛等一些雜環(huán)類化合物以及異丁醛、異戊醛、異丁酸、乙酸乙酯等,表明溫度對這些物質(zhì)有重要的影響。此外,所有樣品均在95%的置信區(qū)間內(nèi),因此可以基于PCA進(jìn)行監(jiān)督分析,即OPLS-DA。
由圖6-B可知,不同溫度條件下食醋樣品聚類區(qū)分明顯,表明溫度能明顯影響食醋的風(fēng)味特征。對模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(200次),結(jié)果顯示未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象,說明該OPLS-DA模型有效。
為了明確溫度對食醋中風(fēng)味物質(zhì)的影響,將25和40 ℃樣品分為一組,55℃樣品為另一組,進(jìn)行OPLS-DA模型分析。通過化合物的變量投影重要性(variable importance in the projection, VIP)以及S-plot分析,選取VIP>1的化合物(對分組貢獻(xiàn)比較大)在S-plot圖上標(biāo)記,對具有差異性的標(biāo)志物可視化。
由圖7可知,H23(5-羥甲基糠醛)、H8(糠醛)、E2(3-羥基-2-丁酮)、E1(2,3-丁二酮)和D2(乳酸乙酯)是由溫度引起差異的主要風(fēng)味物質(zhì),表明在食醋陳釀過程中,5-羥甲基糠醛、糠醛、3-羥基-丁酮、2,3-丁二酮、乳酸乙酯等物質(zhì)的含量受溫度影響較大。
圖7 不同溫度條件下樣品OPLS-DA S-plot圖
2.2.2 基于PCA和OPLS-DA分析氧氣對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響
將不同氧氣條件下食醋樣品進(jìn)行PCA分析,提取3個主成分,累計貢獻(xiàn)率72.0%。如圖8-A所示,長時間陳釀、溶氧量高的樣品附近聚集著一些吡嗪類物質(zhì)如2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等以及香草醛、煙酸乙酯、異丁酸等,表明氧氣對其有重要的影響作用。此外,結(jié)果顯示所有的樣品均在95%的置信區(qū)間內(nèi)。對樣品進(jìn)行OPLS-DA分析(圖8-B)可知,不進(jìn)行充氧與進(jìn)行充氧操作的食醋樣品有明顯的聚類區(qū)分,表明在陳釀過程中,氧氣能明顯影響食醋的風(fēng)味特征。同時,有效性驗(yàn)證結(jié)果表明模型具有可靠性。
WO2-不充氧;MO2-每月充氧;BO2-半月充氧
將不充氧樣品歸為一組,每月充氧和半月充氧樣品歸為另一組,進(jìn)行OPLS-DA模型分析。在S-plot圖上標(biāo)記VIP>1的風(fēng)味物質(zhì)。由圖9可知,在陳釀過程中,氧氣能明顯影響E1(2,3-丁二酮)、B1(異丁醛)、B2(異戊醛)、B4(苯甲醛)、C5(異丁酸)、C6(異戊酸)、H8(糠醛)、A1(異戊醇)和G4(3-甲硫基丙醇)的含量變化。
圖9 不同氧氣條件下醋樣分析的OPLS-DA S-plot圖
本研究采用SPE和HS-SPME結(jié)合GC-MS對陳釀過程中不同溫度和氧氣條件下鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)酸類、醇類、酯類、醛酮類、酚類、含硫類以及雜環(huán)類化合物進(jìn)行定量檢測,并通過PCA和OPLS-DA等多元統(tǒng)計方法對結(jié)果進(jìn)一步分析。結(jié)果表明,貯存環(huán)境因素溫度和氧氣對食醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有顯著的影響,大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)同時受溫度、氧氣的作用。PCA和OPLS-DA均可對不同處理?xiàng)l件下食醋樣品進(jìn)行有效的區(qū)分,55 ℃和25、40 ℃食醋樣品區(qū)分明顯,不充氧和充氧的食醋樣品區(qū)分明顯。溫度對5-羥甲基糠醛、糠醛、3-羥基-丁酮、2,3-丁二酮、乳酸乙酯影響顯著,氧氣能明顯影響2,3-丁二酮、異丁醛、異戊醛、苯甲醛、異丁酸、異戊酸、糠醛、異戊醇和3-甲硫基丙醇的含量變化。研究結(jié)果表明,食醋在陳釀過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)受溫度、氧氣協(xié)同作用影響,因此可以通過對溫度和氧氣的控制加速食醋陳釀進(jìn)程,進(jìn)而調(diào)控食醋風(fēng)味品質(zhì)。