陳紅娜，葉 剛，陳 銀，吳治明，黃志光，鮮 軍，楊維芳，崔侖標(biāo)，張育富，褚宏亮

蜱屬蛛形綱寄螨目，可攜帶病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體，為重要的自然疫源性疾病和人獸共患病的傳播媒介。蜱種類和蜱傳病原體在我國(guó)不同省份的分布不同，在空間和時(shí)間上分布不均[1]。新疆維吾爾自治區(qū)是我國(guó)最大的省份，面積占全國(guó)的1/6以上，蜱種類豐富。據(jù)文獻(xiàn)記載新疆迄今已發(fā)現(xiàn)蜱類2科10屬49種，占全國(guó)已知蜱類的1/3以上，新疆蜱媒疾病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10多種[2]。近年，新疆邊境地區(qū)毗鄰的周邊國(guó)家新現(xiàn)多種蜱傳疾病，但是新疆北部的克拉瑪依地區(qū)，對(duì)蜱攜病原體和其所致疾病缺乏研究[3]。本研究旨在調(diào)查新疆克拉瑪依地區(qū)蜱種類及其攜帶的病原體，為該地區(qū)蜱傳疾病的防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1蜱采集與鑒定 本研究從克拉瑪依市不同地區(qū)(克拉瑪依、烏爾禾、獨(dú)山子和白堿灘)的植被或家畜中采集蜱，收集到離心管中，記錄采集點(diǎn)、經(jīng)緯度、宿主種類、采集日期等信息。利用分類圖譜對(duì)蜱的種類進(jìn)行鑒定。

1.2DNA提取 按照蜱種類和采集時(shí)間、地點(diǎn)和寄生宿主，將1～5個(gè)成蜱放入1.5 mL EP管中。用70%的乙醇將蜱在試管中清洗3次，然后用解剖刀切開。利用組織研磨器(購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司)研磨均化樣品，按照試劑盒說(shuō)明書(購(gòu)于Roche公司)提取基因組DNA和RNA，-80 ℃凍存。

1.3PCR擴(kuò)增 采用熒光定量RT-PCR或套式PCR試劑盒，對(duì)蜱中可能存在的多種病原體進(jìn)行分子檢測(cè)。采用套式和半套式PCR兩種方法分別檢測(cè)巴貝斯蟲/泰勒蟲(Babesia/Theileria)和斑點(diǎn)熱群立克次體(Spottedfevergrouprickettsiae, SFGR)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR用于檢測(cè)發(fā)熱伴血小板減少綜合征新布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus, SFTSV)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus, CCHFV)、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV)、貝氏立克次體(Rickettsiaburnetii)、伯氏疏立克次體(Borreliaburgdorferisensu lato)和恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi, O.t)，查菲埃立克次體(ehrlichiachaffeensis)。PCR檢測(cè)方法、目的基因、引物等詳見表1。

表1 PCR檢測(cè)方法、目的基因、引物序列
Tab.1 PCR methods，Target genes, primers sequence used for pathogens identification

病原體種類方法目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp參考文獻(xiàn)巴貝斯蟲/泰勒蟲Nested PCR18S rDNABab-outF (AATTACCCAATCCTGACACAGG)Bab-outR (TTTGGCAGTAGTTCGTCTTTAACA)540[11-12]Bab-inF (GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA)Bab-inR (CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC)421新疆出血熱病毒Real-time RT-PCRS segmentCCHFs-f ( TCTCAAAGAAACACGTGCC)CCHFs-r ( CYTTYTTRAACTCYTCAAACC)CCHFs-p (FAM- ACTCAAGDKAACACTGTGGGCGTAAG-BHQ)[13]恙蟲病立克次體Real-time RT-PCR47-kD outer membrane protein geneOtsuFP630 (AACTGATTTTATTCAAACTAATGCTGCT)OtsuRP747 (TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT)OtsuPR665 (FAM-TGGGTAGCTTTGGTGGACCGATGTTTA-ATC T-TAMRA_)[14]斑點(diǎn)熱群立克次體Seminested PCROmpA geneRr190-70 ( ATGGCGAATATTTCTCCAAAA)Rr190-701( GTTCCGTTAATGGCAGCATCT)632[15]Rr190-602( AGTGCAGCATTCGCTCCCCCT)532貝氏立克次體Real-time RT-PCRISllla geneISllla-f ( TGGGCTGCGTGGTGATG)ISllla-r ( TGACGTGCTGCGGACTGAT)ISllla-p (FAM- CGTGTGGAGGAGCGAACCATTGGTAT-BHQ)[16]表1(續(xù))病原體種類方法目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp參考文獻(xiàn)查菲埃立克次體Real-time PCR16S rRNAECH16S-17 (5-GCGGCAAGCCTAACACATG-3_)ECH16S-97 (5-CCCGTCTGCCACTAACAATTATT-3_)ECH16S-38 (5-AGTCGAACGGACAATTGCTTATAAC-CTTTTGGT-3_)[17]伯氏疏螺旋體Real-time PCR16S rRNABorre 16S-F GCTTCGCTTGTAGATGAGTCTGBorre 16S-R GCGGAAGATTCTTAGCTGCTGBorre 16S-P FAM-CCGTATCTCAGTTCCAGTGTGACCG- E-clipse)[18]布尼亞病毒Real-time PCRS segmentSFTSV-F-GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAASFTSV-R-TGCCTTCACCAAGACTATCAATGTFAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ1[19]蜱傳腦炎病毒Real-time PCRNS5TBEVNS-F GATCAAGTTCAGAGCGGGAATGTBEVNS-R CGATGTCACACATGATGGTATCAGTBEVNS-P FAM-ATGTGTTCAGCATGCAACCACACCGA-BHQ[20]

1.4同源性比對(duì)分析 將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送生工生物公司測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果通過NCBI的BLAST程序在線檢索分析。本研究引用我國(guó)及其他國(guó)家和地區(qū)分離的覆蓋11個(gè)基因型的18株SFGR毒株，其中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體(Anaplasmaphagocytophilum)毒株為外群(圖1)，通過MEGA 6軟件繪制OmpA基因核苷酸序列進(jìn)化樹；26株巴貝斯蟲/泰勒蟲的18SrDNA基因，其中銅平鲉(SebastesCaurinus)毒株為外群(圖2)繪制核苷酸序列進(jìn)化樹。 繪制方法為Neighbor-joining法(參數(shù)設(shè)置為500 replications)。

2 結(jié) 果

2.1蜱鑒定 從宿主動(dòng)物(狗、羊、山羊、牛、馬)和環(huán)境(哈羅木、沙漠、楊樹)中共采集硬蜱683只，其中銀盾革蜱(Dermacentorniveus) 311只 (45.53%)，亞東璃眼蜱(Hyalommaasiaticumkozlovi) 362只(53%)，圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalushaemaphysaloides)10只(1.47%)。

2.2病原體檢測(cè)與鑒定 經(jīng)PCR檢測(cè)， 檢測(cè)陽(yáng)性率按最小概率即每份陽(yáng)性樣本中1只蜱陽(yáng)性計(jì)算，銀盾革蜱中斑點(diǎn)熱群立克次體的陽(yáng)性率為3.2%(10/311)，巴貝斯蟲的陽(yáng)性率為1.0%(3/311)。亞東璃眼蜱中巴貝斯蟲的陽(yáng)性率為0.8%(3/362)，泰勒蟲陽(yáng)性率為0.3%(1/362)。圖蘭扇頭蜱中未檢測(cè)到陽(yáng)性病原體。SFTSV、CCHFV、TBEV、貝氏立克次體、伯氏疏立克次體、恙蟲病東方體和查菲埃立克次體等檢測(cè)均為陰性，且所有蜱中均未檢測(cè)到兩種或兩種以上病原體(表2)。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所獲SFGR陽(yáng)性樣本與多種已知SFGRompA基因序列同源，同源性高達(dá)93%～100%。 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示本研究所獲10個(gè)樣本均位于進(jìn)化樹勞氏立克次體R.raoultii分支上(圖1)。 巴貝斯蟲/泰勒蟲目的片段18SrDNA序列分別與環(huán)形泰勒蟲Theileriaannulata、駑巴貝斯蟲BabesiaCaballi、BabesiaOccultans等高度同源(圖2)。

表2 PCR檢測(cè)蜱樣本的SFG立克次體和巴貝斯蟲/泰勒蟲的陽(yáng)性率
Tab.2 Total number of ticks (total number of pools) and the minimum field infection rate forSFGrickettsiaeandBabesia/Theileria

蜱種類總數(shù)(只)總數(shù)(份)斑點(diǎn)熱群立克次體陽(yáng)性率(%)巴貝斯蟲陽(yáng)性率(%)泰勒蟲陽(yáng)性率 (%)銀盾革蜱31164103.231.000亞東璃眼蜱362920030.810.3圖蘭扇頭蜱102000000總計(jì)683158101.560.910.2

注：“■”代表本研究所檢測(cè)到的病原體樣本圖1 斑點(diǎn)熱群立克次體的OmpA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the ompA gene sequence of Rickettsia

注：“■”數(shù)字代表本研究所檢測(cè)到的病原體樣本。圖2 巴貝斯蟲/泰勒蟲18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 18SrDNA gene sequence of Babesia/ Theileria

3 討 論

新疆是我國(guó)蜱種多樣、蜱傳疾病高發(fā)地區(qū)之一，本研究中在新疆克拉瑪依市4個(gè)區(qū)共采集到銀盾革蜱、亞東璃眼蜱和圖蘭扇頭蜱等3種蜱，其中荒漠中的游離蜱主要是亞東璃眼蜱，在烏爾禾區(qū)養(yǎng)殖基地的牛、羊身體上除亞東璃眼蜱外，有數(shù)量較多的銀盾革蜱。銀盾革蜱成蟲主要寄生于牛、馬、羊、駱駝等大型哺乳動(dòng)物，也侵襲人；幼蟲和若蟲多寄生于嚙齒類動(dòng)物。2012 年田占成等報(bào)告伊犁新源縣采集主要蜱種為銀盾革蜱[4]。在我國(guó)已證實(shí)銀盾革蜱能夠傳播巴貝斯蟲病，從其體內(nèi)分離到萊姆病螺旋體、北亞斑點(diǎn)熱立克次體；亦有文獻(xiàn)記載其攜帶克里木-剛果出血熱病毒[5]。

巴貝斯蟲病是由巴貝斯蟲引起的一種蜱傳人獸共患寄生蟲病。自1982年起，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)11種巴貝斯蟲，已有文獻(xiàn)報(bào)告分歧巴貝斯蟲、微小巴貝斯蟲和獵戶巴貝斯蟲引起人群感染[6]。目前，我國(guó)對(duì)巴貝斯蟲病疫源地分布范圍和流行規(guī)律、宿主動(dòng)物和媒介蜱攜帶巴貝蟲的能力和傳播該病原體的生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚。弩巴貝斯蟲已在我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古和甘肅省的森林革蜱和草原革蜱中檢出[7-8]，我們從亞東璃眼蜱和銀盾革蜱中檢出弩巴貝斯蟲尚屬國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

本次調(diào)查在烏爾禾區(qū)采集的銀盾革蜱中檢測(cè)到勞氏立克次體是一種新發(fā)現(xiàn)的SFGR，目前已從多個(gè)國(guó)家和地區(qū)革蜱屬中檢出。近幾年，從我國(guó)及周邊國(guó)家的革蜱屬中檢測(cè)到勞氏立克次體[9-10]。大多數(shù)立克次體感染的蜱是從狗、牛和植物中采集的，提示該地區(qū)存在蜱傳播給動(dòng)物所有者、牧羊人和農(nóng)民的風(fēng)險(xiǎn)。本研究首次在新疆克拉瑪依地區(qū)的銀盾革蜱和亞東璃眼蜱中檢測(cè)到了勞氏立克次體和弩巴貝斯蟲，提示克拉瑪依市及周邊地區(qū)存在斑點(diǎn)熱、巴貝斯蟲病的自然疫源地，因此有必要加強(qiáng)對(duì)這些蜱傳疾病的防控。

利益沖突：無(wú)