李俊強，張凱慧，崔朝輝，王榮軍，菅復春，張素梅，寧長申，張龍現(xiàn)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的人獸共患腸道原蟲，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)導致多起食源性和水源性隱孢子蟲病暴發(fā)[1-2]，主要引起腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀，特別是兒童或免疫缺陷病人對其更為敏感[1,3]。新鮮蔬菜是每日健康飲食中一個重要的組成部分，也是一些病原重要的傳播媒介[4-5]。近年來與新鮮蔬菜有關的食源性疾病相關報道數(shù)量急劇增加，大量研究表明許多腸道寄生蟲的感染與食入生的或未經(jīng)煮熟的蔬菜具有顯著的相關性[6-9]。自上世紀90年代以來，在世界范圍內(nèi)時有隱孢子蟲暴發(fā)感染的報道，溯源研究表明生食蔬菜存在隱孢子蟲感染風險[1,10]。然而要檢測蔬菜表面攜帶的病原體，其洗脫和檢測方法至關重要。本研究以生菜為研究對象，創(chuàng)建了一種巢式PCR檢測生菜表面的微小隱孢子蟲卵囊的檢測方法，為蔬菜的食品安全提供新的技術方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1生菜樣品來源 新鮮生菜樣品分批次購自鄭州市區(qū)某大型生活類超市，使用前置于4 ℃冰箱，在購置24 h內(nèi)使用完畢。

1.1.2隱孢子蟲卵囊 隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)卵囊是由河南農(nóng)業(yè)大學寄生蟲學實驗室保存并提供，通過收集隱孢子蟲連續(xù)傳代的犢牛糞便，經(jīng)蔗糖及氯化銫(CsCl)密度梯度離心法純化獲得隱孢子蟲卵囊[11]。

1.1.3洗滌溶液種類 參照相關文獻[12-14]，洗滌液種類有：去離子水；0.1 mol/L 甘氨酸；0.1 mol/L PBS；1% SDS(十二烷基硫酸鈉)；1% Tween-20；1% Alconox。

1.2卵囊計數(shù)及種植方法 使用血球計數(shù)板在顯微鏡(OLYMPUS CX21)下進行隱孢子蟲卵囊計數(shù)。然后將隱孢子蟲卵囊液分別制備為每份4.4×105個卵囊(體積為100 μL)，用于生菜表面卵囊的人工“種植”。將新鮮生菜樣品(每份25 g)分開置于實驗臺(避免樣品交叉污染)，使用微量移液器將含有4.4×105個隱孢子蟲卵囊液(100 μL)多點(8～10個)“種植”于生菜表面。每組試驗均設置1個空白對照組(“種植”同體積去離子水)與3個平行試驗組。

1.3卵囊的洗脫方法優(yōu)化 使用BagPage400無菌過濾袋(19 cm×30 cm, 400 mL, Interscience Lab. Inc., Boston, MA, US)，洗脫方法在Shields等[13]研究基礎上進行適當優(yōu)化。

1.3.1洗脫次數(shù)的比較 制備4份生菜樣本(編號1～4號)，分別“種植”隱孢子蟲卵囊(1號：去離子水100 μL；2～4號：卵囊液100 μL)；室溫(15～20 ℃)放置3 h，將生菜樣品轉移入BagPage無菌過濾袋中，再加入洗滌液(去離子水)100 mL，然后封口并標記。振蕩方式設置為回旋振蕩，振蕩頻率設置為200次/min，振蕩總時間為1 h(期間每15 min翻轉1次)。振蕩完畢后，將第1次洗脫液轉移到2個50 mL離心管中；再將100 mL洗滌液加入同一過濾袋充分混勻后，將其洗脫液再轉移到另2個50 mL離心管中，依次進行，共進行6次洗脫。

1.3.2振蕩方式的優(yōu)化 制備8份生菜樣本(編號5～12號)，分為2組。分別“種植”隱孢子蟲卵囊，室溫放置3 h，將生菜樣品轉移入過濾袋中，再加入洗滌液(去離子水)100 mL。振蕩頻率為200次/min，振蕩時間為1 h。振蕩方式分別設置為往返振蕩(5～8號)與回旋振蕩(9～12號)。

1.3.3振蕩頻率的優(yōu)化 制備16份生菜樣本(編號13～28號)，分為4組。振蕩方式為往返振蕩，振蕩時間為1 h。振蕩頻率分別設置為0次/min(13～16號)、100次/min(17～20號)、200次/min(21～24號)和300次/min(25～28號)。

1.3.4振蕩時間的優(yōu)化 制備16份生菜樣本(編號29～44號)，分為4組。振蕩方式為往返振蕩，振蕩頻率為100次/min。振蕩時間分別設置為0 h(29～32號)、0.5 h(33～36號)、1 h(37～40號)和3 h(41～44號)。

1.3.5洗滌液的優(yōu)化 制備28份生菜樣本(編號45～72號)，分為7組。振蕩方式為往返振蕩，振蕩頻率為100次/min，振蕩時間分別為1 h。洗滌液分別設置為去離子水(45～48號)、0.1 mol/L PBS(49～52號)、1% NaCl(53～56號)、1 mol/L甘氨酸(58～60號)、1% SDS(61～64號)、1% Alconox(65～68號)和1% Tween-20(69～72號)。

1.4洗脫液的回收與卵囊計數(shù) 振蕩完畢之后，將無菌袋中的第1次洗脫液收集于兩個50 mL的離心管中，然后再加入與之前該樣品相同的洗滌液，并進行充分混勻收集第2次洗脫液。方法1.3.1共進行了6次洗脫液的收集，而方法1.3.2～1.3.5中分別進行2次洗脫液的收集。將收集洗脫液置于高速離心機中，3 500 r/min(2 150 g)離心10 min，棄上清，將得到的洗脫液轉移到2 mL的離心管中。再將2 mL離心管在15 000 r/min(15 160 g)離心5 min，棄上清，最后濃縮為500 μL洗脫液。最后使用血球計數(shù)板計數(shù)，每個樣本分別計數(shù)至少3次，求其平均數(shù)。根據(jù)洗脫液的體積計算其回收的隱孢子蟲卵囊總數(shù)，并計算其總體回收率。

1.5 洗脫液中卵囊DNA提取的優(yōu)化

1.5.1卵囊DNA的提取 制備36份相同數(shù)量的隱孢子蟲卵囊液(每份4.4×105個卵囊)，平均分3組。3種商業(yè)化DNA提取試劑盒分別為：土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，MP bio)、糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A Stool DNA kit)和組織DNA提取試劑盒(CW0546，康為世紀)，按照說明書分別進行病原體DNA的提取。

為比較不同試劑盒提取DNA的含量和純度的穩(wěn)定性，提取的DNA使用微量紫外分光光度計(Nanodrop，ND-1000)測量其濃度，以及OD260/OD280比值檢測其純度，每份樣品測定3次，計算其平均數(shù)，以及DNA的提取率[15-16]，用平均數(shù)表示。

為比較不同試劑盒提取DNA的敏感性，分別制備不同濃度的隱孢子蟲卵囊液103個、102個、101個、100個(體積：200 μL，溶液：去離子水)，分別使用土壤DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒提取含有不同數(shù)量的隱孢子蟲卵囊DNA。

1.5.2隱孢子蟲特異性基因的擴增 提取的隱孢子蟲卵囊DNA，使用巢式PCR擴增其gp60基因片段[17]。外引物：AL3531(5′-ATAGTCTCCGCTGTATTC-3′)/ AL3534(5′-CGAGGACGGTTCCAAAGG-3′)，內(nèi)引物：AL3532(5′-TCCGCTGTATTCTCAGCC-3′)/AL3533(5′-GAGATATA-TCTTGGTGCG-3′)，預計擴增片段大小為531bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成。PCR擴增酶為KOD-Plus-Neo(KOD-401)，模板量為1 μL，兩次PCR的退火溫度均設定為55 ℃。分別進行12份平行樣本的巢式PCR擴增，第2次擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，置于紫外成像儀下進行鑒定。

1.6統(tǒng)計學分析 所獲得的隱孢子蟲卵囊回收率和提取的DNA濃度分別進行χ2檢驗比較其差異。使用SPSS 22.0軟件，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1不同洗脫次數(shù)的對比 所檢測的4份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的1號樣本使用顯微鏡未檢測到隱孢子蟲卵囊。種植了隱孢子蟲卵囊的洗脫液中，第1次洗脫回收的隱孢子蟲卵囊數(shù)量最多，隨后依次減低；然而到第5次及第6次洗脫液，顯微鏡計數(shù)顯示均為0(表1)。由此可見，第1次和第2次洗脫液可回收較高的隱孢子蟲卵囊(χ2=81.21，P<0.01)。

表1 不同洗滌次數(shù)條件下隱孢子蟲卵囊的回收情況
Tab.1 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different elution times

Group IDFirstSecondThirdFourthFifthSixthTotal10000000272.0010.331.670.330084.33378.339.331.330.670089.67470.6712.332.000.670085.67

2.2不同振蕩方式的比較 所檢測的8份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的5號和9號樣本使用顯微鏡未檢測到隱孢子蟲卵囊。種植了隱孢子蟲卵囊的洗脫液樣本中，往返振蕩和回旋振蕩的回收卵囊的平均值分別為91.33與62.78；其總回收率分別為51.89%和35.67%(表2)。由此可見，采用往返振蕩較回旋振蕩的隱孢子蟲卵囊回收率高(χ2=5.20，P<0.05)。

表2 不同振蕩方式條件下隱孢子蟲卵囊的回收情況
Tab.2 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different oscillation patterns

Group IDOscillation patternsFirstSecondTotalAverage5Roundtrip oscillations00006Roundtrip oscillations81.0012.3393.3391.337Roundtrip oscillations94.339.33103.678Roundtrip oscillations61.0016.0077.009Cyclotron oscillations000010Cyclotron oscillations70.005.3375.3362.7811Cyclotron oscillations53.335.0058.3312Cyclotron oscillations49.675.0054.67

2.3不同振蕩頻率的比較 所檢測的16份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的13號、17號、21號、25號樣本使用顯微鏡均未檢測到隱孢子蟲卵囊。種植了隱孢子蟲卵囊的洗脫液樣本中，振蕩頻率為0次/min、100次/min、200次/min、300次/min，其卵囊回收的平均值分別為64.11、87.78、57.44、54.22；總回收率分別為36.42%、49.89%、32.64%、30.81%(表3)。由此可見，采用振蕩頻率為100次/min時隱孢子蟲卵囊回收率較高(χ2=9.43，P<0.05)。

表3 不同振蕩頻率條件下隱孢子蟲卵囊的洗脫回收情況
Tab.3 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different oscillation frequency

Group IDOscillation frequencytimes/minFirstSecondTotalAverage130000014048.3315.0063.3364.1115034.6714.3349.0016071.009.0080.001710000001810059.6714.0073.6787.781910077.3316.3393.672010083.3312.6796.002120000002220043.3313.3356.6757.442320040.0013.3353.332420052.0010.3362.332530000002630053.339.0062.3354.222730039.6712.3352.002830038.0010.3348.33

2.4不同振蕩時間的比較 所檢測的16份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的29號、33號、37號、41號樣本使用顯微鏡均未檢測隱孢子蟲卵囊。種植了隱孢子蟲卵囊的洗脫液樣本中，震蕩時間為0 h、0.5 h、1 h、3 h的卵囊回收平均值分別為57.78、81.44、95.00、45.67；其總回收率分別為32.84%、46.27%、53.98%、25.95%(表4)。由此可見，采用振蕩時間為1 h時隱孢子蟲卵囊回收率較高(χ2=19.91，P<0.01)。

2.5不同洗滌液的比較 所檢測的28份生菜樣本中，種植了去離子水的45號、49號、53號、57號、61號、65號和69號樣本使用顯微鏡均未檢測隱孢子蟲卵囊。種植了隱孢子蟲卵囊的洗脫液樣本中，洗滌液為去離子水、0.1 mol/L PBS、1% NaCl、1 mol/L甘氨酸、1% SDS、1% Tween-20、1% Alconox的卵囊平均回收數(shù)分別為76.11、83.89、87.45、34.11、97.11、84.78、125.67；其總回收率分別為43.24%、47.66%、49.69%、19.38%、55.18%、48.17%、71.40%(表5)。由此可見，采用的洗滌液為1% Alconox時隱孢子蟲卵囊回收率較高(χ2=58.02，P<0.01)，而甘氨酸的回收率最低。

表4 不同振蕩時間條件下隱孢子蟲卵囊的洗脫回收情況
Tab.4 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different oscillation time

Group IDOscillation time/hFirstSecondTotalAverage290000030049.009.6758.6757.7831046.006.3352.3332050.6711.6762.33330.50000340.570.6718.3389.0081.44350.551.6716.3368.00360.569.3318.0087.33371000038192.0010.33102.3395.0039182.3310.3392.6740176.3313.6790.00413000042324.679.6734.3345.6743330.0011.0041.0044348.3313.3361.67

2.6生菜表面污染隱孢子蟲卵囊總體回收率 采取往返振蕩的振蕩方式，振蕩頻率為100次/min，振蕩時間為1 h(每15 min翻轉1次)，洗脫液采用1% Alconox溶液時，其隱孢子蟲卵囊洗脫回收率達到最高。血球計數(shù)板顯微鏡計數(shù)分別采用第1次和第2次洗脫回收得到隱孢子蟲卵囊個數(shù)之和計數(shù)，其卵囊總體平均回收個數(shù)為31.42×104，則其總體回收率最高達到71.40%(χ2=58.02，P<0.01)(表6)。

2.7 洗脫液中卵囊DNA提取方式的優(yōu)化

2.7.1提取DNA的濃度、純度和提取率比較 3種商業(yè)化試劑盒提取隱孢子蟲卵囊DNA濃度方面，組織DNA試劑盒所提取的DNA平均濃度最高為(23.37±0.91) ng/μL；糞便DNA提取試劑盒提取的DNA濃度次之為(8.28±1.97) ng/μL；土壤DNA提取試劑盒提取的DNA濃度最低為(6.89±2.97) ng/μL。其次，3種試劑盒提取DNA純度方面，組織DNA試劑盒所提取DNA的OD260/OD280平均值最低為1.09±0.70，顯示其蛋白含量較高；糞便DNA提取試劑盒所提取DNA的OD260/OD280平均值適中為1.92±1.28，顯示純度適中；土壤DNA提取試劑盒所提取的DNA的OD260/OD280平均值最高為2.17±3.18，顯示其RNA含量較高。再次，三種試劑盒獲得DNA提取率方面，組織DNA提取試劑盒的DNA平均提取率最高，但其DNA的蛋白含量顯著高；土壤DNA提取試劑盒次之，其提取的DNA中RNA的含量較高；而糞便DNA提取試劑盒提取的DNA提取率最低，但其純度較高(表7)。

表5 不同洗滌液條件下隱孢子蟲卵囊的洗脫回收情況
Tab.5 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different elution solutions

Group IDElution solutionsFirstSecondTotalAverage45Deionized water000046Deionized water82.339.3391.6776.1147Deionized water50.6712.6763.3348Deionized water63.0010.3373.33490.1 mol/L PBS0000500.1 mol/L PBS74.337.6782.0083.89510.1 mol/L PBS80.004.3384.33520.1 mol/L PBS78.337.0085.33531% NaCl0000541% NaCl82.335.3387.6787.45551% NaCl88.675.0093.67561% NaCl74.676.3381.00571 mol/L Glycine0000581 mol/L Glycine28.005.3333.3334.11591 mol/L Glycine28.335.3333.67601 mol/L Glycine30.005.3335.33611% SDS0000621% SDS92.674.3397.0097.11631% SDS96.337.67104.00641% SDS86.673.6790.33651% Tween-200000661% Tween-2083.335.3388.6784.78671% Tween-2083.003.3386.67681% Tween-2076.003.0079.00691% Alconox○R0000701% Alconox○R126.004.00130.00125.67711% Alconox○R113.673.67117.33721% Alconox○R125.334.33129.67

2.7.2提取DNA的穩(wěn)定性 3種試劑盒提取隱孢子蟲卵囊DNA濃度和純度穩(wěn)定性比較分析顯示：DNA濃度方面，組織DNA提取試劑盒獲得DNA濃度最高，糞便DNA提取試劑盒次之，土壤DNA提取試劑盒最低；其中，土壤DNA提取試劑盒提取DNA濃度的穩(wěn)定性最高。DNA純度方面，土壤DNA提取試劑盒最高，糞便DNA提取試劑盒次之，組織DNA提取試劑盒獲得DNA純度最低；其中，糞便DNA提取試劑盒提取DNA純度穩(wěn)定性最高。

2.7.3提取DNA的特異性 3種試劑盒提取的卵囊DNA為模板的巢式PCR擴增結果顯示，土壤DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒提取的DNA均全部成功擴增12份樣品，而組織DNA提取試劑盒提取的DNA僅成功擴增4份。由此可見提取水溶液中隱孢子蟲卵囊DNA時，糞便DNA提取試劑盒和土壤DNA提取試劑盒提取隱孢子蟲卵囊DNA的特異性顯著性高于組織DNA提取試劑盒(χ2=71.80，P<0.01)。

2.7.4提取DNA的敏感性 3種試劑盒提取的卵囊DNA樣品敏感性檢測，只進行了兩種試劑盒(糞便DNA提取試劑盒和土壤DNA提取試劑盒)對于不同梯度的隱孢子蟲卵囊DNA的巢式PCR擴增。結果顯示這兩種試劑盒提取的隱孢子蟲卵囊DNA的巢式PCR擴增的敏感性均為10～100個卵囊之間。

表6 不同洗滌液條件下隱孢子蟲卵囊的回收數(shù)量與回收率
Tab.6 Recovery and rate ofCryptosporidiumoocysts by different elution solutions

Elution solutionsRecovery number and recovery rate of the oocystsFirst recovery number(×104)First recovery rate(%)Second recovery number(×104)Second recovery rate(%)Total recovery number(×104)Total recovery rate(%)Deionized water16.3337.122.696.1219.0343.240.1 mol/L PBS19.3944.061.583.6020.9747.661% NaCl20.4746.531.393.1621.8649.691 mol/L Glycine7.1916.351.333.038.5319.381% SDS22.9752.211.312.9724.2855.181% Tween-2020.1945.890.9742.2121.2048.171% Alconox○R30.4269.131.002.2731.4271.40

表7 不同試劑盒提取DNA的濃度、純度和提取率(n=12)
Tab.7 Concentration, purity and extraction rate of extracted DNA from different kits

DNA kits typesConcentration(ng/μL)Purity(OD260/OD280)Extraction rate(ng/μL)Stool kit8.28±1.97a1.92±1.28d8.28±1.97aSoil kit6.89±2.97a2.17±3.18e6.89±2.97aTissue kit23.37±0.91b1.09±0.70f23.37±0.91b

注：結果以平均數(shù)±標準差表示，同一數(shù)據(jù)列中不同小寫字母顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

隱孢子蟲在世界范圍內(nèi)導致多起食源性和水源性隱孢子蟲病的暴發(fā)[1-2]，并且隱孢子蟲的感染與食入生的或未經(jīng)煮熟的蔬菜有顯著的相關性[6-9]。蔬菜表面攜帶微小隱孢子蟲(C.parvum)卵囊的報道最早可以追溯到1997年[18]，到目前仍然有蔬菜表面污染隱孢子蟲卵囊的報道[19-24]。然而要檢測蔬菜表面攜帶的病原體，首先要建立有效的洗脫和檢測方法[25]。

本研究對蔬菜表面污染的隱孢子蟲卵囊采取往返振蕩方式，振蕩頻率為100次/min，振蕩時間為1 h，洗脫液采用1% Alconox的方法進行洗脫，其總體回收率最高達到71.40%?；诹魇郊毎麅x檢測木莓表面攜帶的微小隱孢子蟲卵囊的報道與本研究得到了相似的結果，洗脫液為去離子水時回收率為(43.2±4.5)%；洗脫液為1 mol/L甘氨酸時木莓表面卵囊回收率為(39.0±7.6)%；洗脫液為去離子水時菠菜表面卵囊回收率為(47.5±3.1)%；洗脫液為1 mol/L甘氨酸時菠菜表面卵囊回收率為(50.3±2.0)%；同樣地，洗脫液為1% Alconox時卵囊回收率最高達到97.2%[13]。Alconox主要有兩種成分：具有表面活性功能的十二烷基苯磺酸鈉(C12H25C6H4SO3Na)和乳化分散性能的焦磷酸鈉(Na4P2O7)[13]。本研究中，1% Alconox洗脫蔬菜表面的隱孢子蟲回收率最高(71.40%)，1% SDS洗脫液次之(55.18%)，并且顯著高于其它洗滌液的回收率。

水溶液中病原體DNA的提取方法有多種，傳統(tǒng)的異丙醇沉淀提取DNA的方法簡單、成本低、能提取到大量的DNA，但獲得的DNA濃度低、且耗時長、純度低、不利于快速的分子生物學研究，然而試劑盒提取DNA具有快速高效而且純度高的優(yōu)點。目前用于提取糞便、土壤、血液、組織中病原DNA的試劑盒較多[14-15]。本研究選擇3種常見商業(yè)化DNA提取試劑盒對水溶液中隱孢子蟲卵囊DNA進行提取，根據(jù)所提取DNA的濃度、純度和提取率，以及擴增微小隱孢子蟲gp60基因的特異性和敏感性進行比較，評價其提取水體中隱孢子蟲卵囊DNA的效果。在3種商業(yè)化試劑盒中，雖然組織DNA提取試劑盒獲得的DNA濃度最高，但其擴增隱孢子蟲gp60基因的特異性顯著低于土壤DNA試劑盒和糞便DNA試劑盒獲得的DNA。推測可能是由于組織DNA提取試劑盒提取獲得了溶液中其它生物體的基因組DNA，未能將隱孢子蟲卵囊壁充分破裂，從而導致未獲得有效隱孢子蟲卵囊DNA。土壤DNA提取試劑盒與糞便DNA提取試劑盒提取的隱孢子蟲卵囊DNA在質(zhì)與量差異無統(tǒng)計學意義。如果考慮到時間成本，土壤DNA試劑盒耗時較短；如果考慮到經(jīng)濟成本，糞便DNA試劑盒提取的單份DNA成本較低。有學者通過PCR方法比較了3種試劑盒(FastDNA SPIN Kit for soil，UltraCleanTMSoil DNA Isolation Kit，QIAamp DNA Mini Stool Kit)及一種新建的DNA提取方法提取蔬菜表面洗脫的微小隱孢子蟲卵囊DNA的質(zhì)量，結果顯示FastDNA試劑盒與土壤DNA試劑盒提取DNA的質(zhì)與量差異也沒有統(tǒng)計學意義[14]。

綜上所述，本研究以生菜為研究對象，對其表面污染的隱孢子蟲卵囊的洗脫方法進行了優(yōu)化及水溶液中隱孢子蟲卵囊DNA的提取進行了比較，建立了巢式PCR檢測蔬菜表面污染隱孢子蟲卵囊的方法，為蔬菜的食品安全提供新的技術方法。

利益沖突：無