劉桂鳳，楊家興，丁 煒，王耀楠，蔡 媛，張 健，王 洋，耿士忠，潘志明，焦新安

腸炎沙門菌(SalmonellaEnteritidis, SE)是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，為重要的人獸共患病原菌之一。該菌無(wú)特異性宿主，不僅能引起畜禽發(fā)病死亡造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且被污染的畜禽產(chǎn)品作為腸炎沙門菌的攜帶者，引發(fā)人食源性疾病危害公共衛(wèi)生安全[1-2]。持續(xù)感染和免疫逃逸是沙門菌一個(gè)致病特征，主要是由于其能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和增殖。沙門菌接觸到宿主細(xì)胞后能黏附于細(xì)胞表面，侵襲進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)生存繁殖，即沙門菌的胞內(nèi)增殖。為了能夠在細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖，沙門菌適應(yīng)性地產(chǎn)生一種沙門菌囊泡結(jié)構(gòu)(Salmonella-containing vacuole, SCV)來(lái)逃避細(xì)胞對(duì)其的吞噬清除[3-4]。沙門菌的III型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ Secretion Systems, T3SS)是一個(gè)由膜內(nèi)/外蛋白組成的多組份跨膜通道，參與沙門菌囊泡的生物發(fā)生和成熟過(guò)程。作為“分子注射器”的T3SS主要功能是分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)蛋白，它主要通過(guò)效應(yīng)蛋白來(lái)改變宿主細(xì)胞的生理活動(dòng)，促進(jìn)沙門菌侵入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)生存[5-6]。III型分泌系統(tǒng)包括T3SS-1和T3SS-2，T3SS-1由沙門菌毒力島1(SPI-1)基因組基因編碼，其效應(yīng)物作用于宿主細(xì)胞質(zhì)膜上以使細(xì)菌入侵和SCV生物發(fā)生；由沙門菌毒力島2(SPI-2)編碼的T3SS-2效應(yīng)物作用于囊泡膜，促進(jìn)SCV成熟、SIF形成和囊泡內(nèi)沙門菌復(fù)制[7-8]。

sifA基因是沙門菌的一個(gè)毒力相關(guān)基因，由T3SS-2分泌的SifA蛋白在SCV的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，sifA基因缺失突變后無(wú)法形成SifA蛋白，對(duì)沙門菌誘導(dǎo)形成SCV造成嚴(yán)重影響，使其不能在吞噬細(xì)胞內(nèi)正常復(fù)制生存[9]。SifA蛋白可能參與沙門菌入侵宿主細(xì)胞[10]及沙門菌引起機(jī)體免疫功能受損[11]。通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞系J774.2與上皮細(xì)胞系HeLa等一些比較成熟的細(xì)胞模型中SCV形成的研究，沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)SCV的形成機(jī)制已經(jīng)逐漸被闡明，但這只針對(duì)少數(shù)血清型的沙門菌，其中研究最多的模式菌就是鼠傷寒沙門菌。而對(duì)于腸炎沙門菌在細(xì)胞內(nèi)增殖及SCV形成機(jī)制的研究比較匱乏，是否與鼠傷寒沙門菌一致，需要進(jìn)一步深入研究予以驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)室無(wú)痕敲除靶基因技術(shù)成熟[12]，利用具有l(wèi)acZ基因的pGMB152自殺質(zhì)粒作為中間載體，通過(guò)藍(lán)白斑篩選的方式，直觀地篩選重組菌，構(gòu)建腸炎沙門菌sifA基因缺失株C50041ΔsifA及雙基因缺失株C50041ΔspiCΔsifA，并研究其基本生物學(xué)特性及其對(duì)胞內(nèi)腸炎沙門菌增殖的影響，為更深入地探索沙門菌胞內(nèi)增殖規(guī)律奠定基礎(chǔ)。對(duì)于腸炎沙門菌在細(xì)胞內(nèi)SCV形成機(jī)制的研究，將有助于進(jìn)一步探究腸炎沙門菌致病機(jī)理，為腸炎沙門菌的防控提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞 本研究中所使用的菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞
Tab.1 Bacterial strains, plasmids and cells used in this study

名稱用途備注C50041受體菌腸炎沙門菌野生株C50041ΔspiC受體菌腸炎沙門菌spiC缺失株C50041(spiC-gfp)受體菌腸炎沙門菌spiC-gfp基因融合E.coli.Spy372pGMB152-ΔsifA克隆pGMB152宿主菌E.coli.χ7213pGMB152-ΔsifA克隆pGMB152宿主菌,DAP依賴pGMB152用于sifA基因敲除的自殺質(zhì)粒Ampr,Smr,lacZRAW264.7用于沙門菌增殖的宿主細(xì)胞鼠源巨噬細(xì)胞

注：來(lái)源均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑 DNA膠回收試劑盒、SalⅠ限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒純化試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、氨芐青霉素(Amp)和鏈霉素(Sm)等抗生素、DNA Marker、IPTG、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Primestar max DNA Polymerase均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；ClonExpress One Step Cloning一步法連接試劑盒以及2×Taq Master mix購(gòu)自南京Vazyme生物科技有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒購(gòu)自羅氏公司；API 20E腸道菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)Bio Mérieux公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌及細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。高效感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒及其他常規(guī)試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成 本研究中所使用的引物堿基序列見(jiàn)表2，引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。

表2 用于PCR擴(kuò)增的引物
Tab.2 Primers used for PCR in this study

PrimesSequence(5′-3′)Size/bpsifA-U-FCCCCCCCTGCAGGTCGACTAATGGGTGGCGCGAAAAAC620sifA-U-RCGCTTTGTTGTTCTGAGCGAATTCGTATTCCTTGGGGAGTTGGsifA-D-FCCAACTCCCCAAGGAATACGAATTCGCTCAGAACAACAAAGCG730sifA-D-RCTTATCGATACCGTCGACCATCACGATATCCGGCGACAsifA-U-FCCCCCCCTGCAGGTCGACTAATGGGTGGCGCGAAAAAC1349(Δ); 2173(WT)sifA-D-RCTTATCGATACCGTCGACCATCACGATATCCGGCGACApGMB152-FCGTGGAGGCCATCAAACCAC283(Δ); 1632(WT)pGMB152-RCGCGAAATAAACGACCGGGAnsifA-FGTTGTCTAATGGAACCGATAATATCGqPCRnsifA-RCTACCCCCTCCCTTCGACAT16S-FCGGGGAGGAAGGTGTTGTGqPCR16S-RGAGCCCGGGGATTTCACATC

注：黑色粗體部分為與pGMB152SalⅠ酶切位點(diǎn)側(cè)翼序列互補(bǔ)配對(duì)片段，sifA-U-R和sifA-D-F為互補(bǔ)序列。

1.4 目的基因與重組自殺載體的制備

1.4.1腸炎沙門菌基因組DNA的提取 將凍存的腸炎沙門菌C50041接種于LB固體平板培養(yǎng)單菌落，將單菌落再接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min連續(xù)震搖培養(yǎng)過(guò)夜，取4 mL菌液利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取腸炎沙門菌C50041基因組DNA。

1.4.2sifA基因上下游同源臂sifA-U和sifA-D片段的擴(kuò)增 以所提C50041基因組DNA為模板，分別以sifA-U-F/R和sifA-D-F/R為引物，利用PCR擴(kuò)增sifA基因上下游同源片段sifA-U、sifA-D片段。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：Primestar max DNA Polymerase 22 μL，引物F(10 μmol/L)2 μL，引物R(10 μmol/L)2 μL，模板DNA 2 μL，滅菌超純水SW 22 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，利用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段。

1.4.3pGMB152質(zhì)粒載體的制備 挑取E.coli. Spy372 (pGMB152)單菌落轉(zhuǎn)接于100 mL含Amp(終濃度100 μg/mL)和Sm(終濃度100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 180 r/min搖床內(nèi)震搖培養(yǎng)過(guò)夜，常規(guī)方法提取質(zhì)粒pGMB152后，再用質(zhì)粒純化試劑盒純化。

純化后的pGMB152質(zhì)粒利用SalⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切。酶切體系(150 μL)：H Buffer 15 μL，SalⅠ 10 μL，pGMB152質(zhì)粒100 μL，滅菌SW 25 μL。酶切反應(yīng)條件：37 ℃，2 h。利用DNA膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，回收產(chǎn)物即為本研究所用線性自殺質(zhì)粒載體。

1.5sifA基因缺失株C50041ΔsifA無(wú)痕構(gòu)建

1.5.1同源重組自殺質(zhì)粒pGMB152-ΔsifA構(gòu)建 利用ClonExpress One Step Cloning一步法連接試劑盒將sifA基因上下游同源片段sifA-U、sifA-D與線性酶切質(zhì)粒PGMB152進(jìn)行連接，構(gòu)建同源重組自殺質(zhì)粒并將其命名為pGMB152-ΔsifA。

1.5.2E.coli. Spy372與E.coli. χ7213感受態(tài)細(xì)菌的制備 分別用LB平板和含 DAP(終濃度100 μg/mL)的平板復(fù)蘇E.coli. Spy372和E.coli. χ7213，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)單菌落。將E.coli. Spy372轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，E.coli. χ7213轉(zhuǎn)接于含DAP的LB液體培養(yǎng)基中，于搖床震搖培養(yǎng)13 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)至含100 mL LB液體培養(yǎng)基中，震搖培養(yǎng)至OD600=0.5左右，按照高效感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒說(shuō)明書(shū)制備E.coli. Spy372與E.coli. χ7213感受態(tài)細(xì)菌。

1.5.3重組沙門菌C50041(pGMB152-ΔsifA的制備 10 μL連接產(chǎn)物(pGMB152-ΔsifA)加入到100 μLE.coli.Spy372感受態(tài)中，置于冰上30 min使其充分接觸，于42 ℃金屬浴熱擊90 s，將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli.Spy372，將轉(zhuǎn)化后的重組菌涂布在含X-gal(終濃度40 μg/mL)、IPTG(終濃度24 μg/mL)、Amp和Sm的LB固體平板上，形成藍(lán)色重組菌E.coli. Spy372(pGMB152-ΔsifA)，經(jīng)自殺質(zhì)粒特異性引物pGMB152-F/R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證正確后，利用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取重組菌E.coli. Spy372(pGMB152-ΔsifA)的重組質(zhì)粒。利用熱轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli.χ7213，轉(zhuǎn)化后的重組菌涂布在含DAP、Amp、Sm、X-gal和IPTG的LB平板上，形成藍(lán)色重組菌E.coli.χ7213(pGMB152-ΔsifA)，鑒定正確后，以腸炎沙門菌野生株C50041為受體菌(構(gòu)建C50041ΔspiCΔsifA時(shí)受體菌為C50041ΔspiC)，重組菌E.coli.χ7213(pGMB152-ΔsifA)為供體菌，按受體菌∶供體菌=1∶4的比例做固相雜交，進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移[13]，固相雜交后混合細(xì)菌用PBS稀釋至合適梯度后涂布在含Amp、Sm、X-gal和IPTG的平板上形成藍(lán)色重組沙門菌C50041(pGMB152-ΔsifA)。

1.5.4質(zhì)粒載體的脫除 挑取沙門菌重組菌C50041(pGMB152-ΔsifA)單菌落接種于不含NaCl、含10%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基中震搖培養(yǎng)過(guò)夜，以脫除自殺質(zhì)粒，然后將菌液稀釋至合適的梯度涂布在含X-gal、IPTG的LB平板上，篩選白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定正確的沙門菌命名為C50041ΔsifA。

1.6 C50041ΔsifA鑒定

1.6.1抗生素耐藥性鑒定 將缺失株C50041 ΔsifA與接合轉(zhuǎn)移后的重組沙門菌C50041(pGMB152-ΔsifA)在同一塊含Amp、Sm的LB固體平板上劃線進(jìn)行抗生素耐藥性驗(yàn)證。

1.6.2菌落藍(lán)白色鑒定 將缺失株C50041 ΔsifA與接合轉(zhuǎn)移后的重組沙門菌C50041(pGMB152-ΔsifA)在同一塊含X-gal、IPTG的LB平板上劃線進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定。

1.6.3PCR鑒定 在缺失株的構(gòu)建中主要通過(guò)菌落PCR進(jìn)行鑒定，挑取一個(gè)單菌落于50 μL的滅菌SW中混勻，此即進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證的模板。 PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：2×Taq mix 12.5 μL，滅菌SW 9.5 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，模板 1 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后，通過(guò)0.7% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.7 生物學(xué)特性鑒定

1.7.1生長(zhǎng)特性鑒定 挑取C50041、C50041-ΔsifA及C50041ΔspiCΔsifA(構(gòu)建方法與C50041ΔsifA單基因缺失株構(gòu)建方法相同)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，次日分別轉(zhuǎn)接到20 mL的LB液體培養(yǎng)基中并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600=0.05。在37 ℃ 180 r/min的搖床中連續(xù)培養(yǎng)12 h，每隔1 h利用分光光度計(jì)測(cè)定各個(gè)菌液的OD600值，并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，以野生株C50041為對(duì)照，觀察sifA基因?qū)δc炎沙門菌生長(zhǎng)速度的影響。

1.7.2生化特性鑒定 挑取新鮮的C50041、C50041ΔsifA及C50041ΔspiCΔsifA菌落于生理鹽水中，利用比濁儀調(diào)整比濁度為0.8左右。參照使用說(shuō)明書(shū)的要求向鑒定卡中加入菌液，將API 20E生化鑒定板置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察并記錄結(jié)果。以野生株C50041為對(duì)照，觀察sifA基因?qū)δc炎沙門菌生化特性的影響。

1.8 C50041ΔsifA在巨噬胞內(nèi)增殖

1.8.1巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%的FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃含5% CO2的條件下培養(yǎng)鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7。在感染細(xì)胞前，用0.25%胰酶消化細(xì)胞1 min，換用含10% FBS無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基吹打懸浮細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為4.0×105CFU/孔，培養(yǎng)18 h待細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)孔底時(shí)，進(jìn)行沙門菌感染。

1.8.2沙門菌感染巨噬細(xì)胞 挑取C50041、C50041ΔspiC、C50041ΔsifA及C50041ΔspiCΔsifA單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min的條件下培養(yǎng)過(guò)夜，用滅菌PBS洗2遍后將細(xì)菌濃度調(diào)整至OD600=1.0。過(guò)夜培養(yǎng)的24孔細(xì)胞板中的鼠源巨噬細(xì)胞換用新的含血清但無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，每孔細(xì)胞加入100 μL的菌液進(jìn)行感染，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，加完細(xì)菌后將細(xì)胞板以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，使細(xì)菌與巨噬細(xì)胞充分接觸，加速細(xì)菌黏附；離心后將細(xì)胞板于細(xì)胞培養(yǎng)箱放置30 min，此階段為細(xì)菌黏附細(xì)胞的過(guò)程；棄掉上清培養(yǎng)基，用PBS洗2遍后加入含100 μg/mL慶大霉素、10% FBS的培養(yǎng)基，殺死未進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌，并將細(xì)胞板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，此時(shí)為細(xì)菌的侵襲過(guò)程；再次棄掉上清，用PBS洗2遍后加入含10 μg/mL慶大霉素、10% FBS的培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。加入含較低濃度的慶大霉素的培養(yǎng)基時(shí)為增殖時(shí)間點(diǎn)的零點(diǎn)，分別取增殖0 h、8.5 h、20 h、24 h的時(shí)間點(diǎn)，用0.2% Triton X-100溶液裂解細(xì)胞而釋放出胞內(nèi)的沙門菌，并進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。以0 h時(shí)的細(xì)菌量為初始值。

1.9sifA基因的表達(dá)

1.9.1胞外菌sifA基因的表達(dá) 過(guò)夜震搖培養(yǎng)的腸炎沙門菌C50041、C50041ΔspiC、C50041ΔsifA和C50041ΔspiCΔsifA1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)至20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，震搖培養(yǎng)至OD600=0.65左右，5 000 r/min離心10 min棄上清，加入1.5 mL PBS和3 mL的RNA保護(hù)劑重懸混勻后5 000 r/min離心10 min,棄上清收集細(xì)菌；再利用RNA提取試劑盒提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，測(cè)定sifA基因表達(dá)量的熒光定量PCR引物為nsifA-F/R，以16S RNA引物16S-F/R為內(nèi)參引物，將野生株C50041的sifA基因表達(dá)量定為1。熒光定量PCR體系(20 μL)：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μL，引物F(10 μmol/L)0.8 μL，引物R(10 μmol/L) 0.8 μL，模板(cDNA) 2 μL，RNase free Water 6.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.9.2胞內(nèi)沙門菌sifA基因的表達(dá) 選擇腸炎沙門菌C50041、C50041ΔspiC、C50041ΔsifA和C50041ΔspiCΔsifA在鼠源巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖1 h、8.5 h、19 h、20 h的時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞提取RNA。沙門菌在胞內(nèi)增殖一定時(shí)間后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗2遍后每孔加入1 mL的細(xì)胞RNA保護(hù)劑，移液槍反復(fù)吹打混勻細(xì)胞，細(xì)胞懸浮后將所有液體轉(zhuǎn)移到去RNA酶的1.5 mL的離心管中，每個(gè)菌每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)重復(fù)。然后利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，此即用于熒光定量PCR的模板。熒光定量PCR體系和程序與胞外sifA基因表達(dá)的熒光定量PCR的體系、程序相同。通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)sifA基因的表達(dá)情況。

1.10數(shù)據(jù)分析 使用GraphPad Prism 8.0.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與整理，并利用該軟件制圖。檢驗(yàn)方法采用t-test檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為ɑ=0.05。

2 結(jié) 果

2.1C50041ΔsifA基因缺失株鑒定

2.1.1重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增sifA基因上下游同源片段，利用一步連接法試劑盒將sifA基因上下游同源片段連接到SalⅠ酶切的自殺質(zhì)粒pGMB152載體上，形成重組自殺質(zhì)粒pGMB152-ΔsifA，轉(zhuǎn)化E.coli. Spy372感受態(tài)細(xì)菌，構(gòu)建重組菌E.coli. Spy37(pGMB152-ΔsifA)。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)sifA-U-F/R和sifA-D-F/R引物對(duì)擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶分別為620 bp和730 bp，大小正確(圖1)。引物PGMB152-F/R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增條帶約為1 632 bp(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致。

M：DL2000 Maker；1：sifA-U同源片段；2：sifA-D同源片段圖1 重組質(zhì)粒中sifA基因上下游同源片段的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR identification of sifA-U and sifA-D of pGMB152-ΔsifA

M：DL2000 Maker；1：E.coli. Spy372(pGMB152-ΔsifA)；2：E.coli. χ7213(pGMB152-ΔsifA)圖2 載體特異引物pGMB152-F/R PCR驗(yàn)證重組菌中pGMB152-ΔsifAFig.2 PCR identification of pGMB152-ΔsifA by pGMB152-F/R

2.1.2構(gòu)建供體重組菌E.coli. χ7213(pGMB152-ΔsifA) 從重組菌E.coli. Spy372(pGMB152-ΔsifA)提取質(zhì)粒pGMB152-ΔsifA，再轉(zhuǎn)化E.coli. χ7213感受態(tài)細(xì)菌中構(gòu)建重組菌E.coli. χ7213(pGMB152-ΔsifA)，利用引物PGMB152-F/R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增出預(yù)期條帶(圖2)。該菌具有DAP生長(zhǎng)依賴性，以作供體菌，便于與受體菌C50041進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移和篩選。

2.1.3重組沙門菌C50041(ΔsifA)構(gòu)建與鑒定 以重組菌E.coli. χ7213(pGMB152-ΔsifA)為供體與C50041受體進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，利用DAP生長(zhǎng)依賴性去除供體菌E.coli. χ7213(pGMB152-ΔsifA)，抗生素去除受體菌C50041，以及LacZ特性篩選藍(lán)色重組沙門菌C50041(pGMB152-ΔsifA)，重組質(zhì)粒pGMB152-ΔsifA進(jìn)入C50041后進(jìn)行上下游同源片段交叉互換，形成藍(lán)色重組沙門菌C50041(pGMB152-ΔsifA)。

自殺質(zhì)粒pGMB152的復(fù)制需要一種特定的蛋白，而腸炎沙門菌C50041中不含該蛋白，所以pGMB152質(zhì)粒在C50041中無(wú)法復(fù)制。用不含NaCl含10%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基傳代后在含X-gal、IPTG的LB平板上的白色菌落有兩種可能：一是同源片段雙交換，sifA基因缺失的菌株，另一種則可能是同源片段不交換，目的基因片段與pGMB152質(zhì)粒一起丟失而回復(fù)為野生株。在傳代過(guò)程中利用引物sifA-U-F/sifA-D-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)兩次脫質(zhì)粒，最終獲得質(zhì)粒脫除的sifA基因缺失株C50041ΔsifA。并分別用sifA-U-F/sifA-D-R和PGMB152-F/R的引物進(jìn)行了PCR驗(yàn)證，證明其正確性，結(jié)果如圖3、圖4。利用sifA-U-F/sifA-D-R的引物擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，且PGMB152-F/R的引物未擴(kuò)增出條帶證明PGMB152質(zhì)粒已脫除，C50041ΔsifA構(gòu)建成功。

M：DL2000；1：C50041(pGMB152-ΔsifA)；2：C50041ΔsifA; 3: 野生株C50041圖3 引物sifA-U-F/sifA-D-R PCR重組沙門菌結(jié)果Fig.3 PCR identification of the recombinant SE strains with primer sets sifA-U-F/sifA-D-R

M：DL2000；1：C50041(pGMB152-ΔsifA)；2：C50041ΔsifA；3：野生株C50041圖4 引物pGMB152-F/R PCR重組沙門菌結(jié)果Fig.4 PCR identification of the recombinant C50041-ΔsifA with primer pGMB152-F/R

A、B：6株sifA基因缺失株的藍(lán)白斑驗(yàn)證；C、D：6株sifA基因缺失株的抗生素耐藥性驗(yàn)證對(duì)照：重組沙門菌C50041 (pGMB152-ΔsifA)；1-6：6株sifA基因缺失株圖5 C50041ΔsifA藍(lán)白斑驗(yàn)證和抗生素耐藥性分析Fig.5 Analysis of blue/white and antibiotic resistances of C50041ΔsifA strains

2.1.4C50041ΔsifA缺失株的抗生素耐藥性和藍(lán)白斑表型驗(yàn)證 未脫除質(zhì)粒的重組菌中含有l(wèi)acZ基因和氨芐青霉素、鏈霉素抗性基因，在IPTG的誘導(dǎo)下它能夠利用X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，表現(xiàn)為藍(lán)色菌落，也可以在含Amp、Sm的平板上正常生長(zhǎng)；而缺失株 C50041ΔsifA完全脫除質(zhì)粒后，失去pGMB152質(zhì)粒所攜帶的lacZ基因和抗性基因，所以在含X-gal、IPTG的平板上表現(xiàn)為白色菌落，在含Amp、Sm的平板上不能正常生長(zhǎng)。驗(yàn)證結(jié)果如圖5，缺失株C50041 ΔsifA在含X-gal、IPTG的平板上表現(xiàn)為白色菌落，在含Amp、Sm的平板上不能生長(zhǎng)，進(jìn)一步說(shuō)明自殺質(zhì)粒已完全脫除。各菌株篩選特性見(jiàn)表3。

表3 沙門菌sifA基因敲除過(guò)程中各菌株篩選特性
Tab.3 Characteristics of bacterial strains during C50041ΔsifAconstruction

BacteriaCharacteristicsblue/whiteSmrAmprDAP dependenceC50041白無(wú)無(wú)無(wú)E.coli. Spy372(pGMB152-ΔsifA)藍(lán)有有無(wú)E.coli. χ7213 (pGMB152-ΔsifA)藍(lán)有有有C50041 (pGMB152-ΔsifA)藍(lán)有有無(wú)C50041 ΔsifA白無(wú)無(wú)無(wú)

2.2C50041ΔsifA的生物學(xué)特性

2.2.1C50041ΔsifA的生長(zhǎng)速度 調(diào)節(jié)C50041、C50041ΔsifA、C50041ΔspiCΔsifA初始菌液濃度均為OD600=0.05，每隔1 h測(cè)一次OD600的值，繪制生長(zhǎng)曲線如圖6。由此圖可以看出缺失株的生長(zhǎng)曲線與野生株基本保持一致，說(shuō)明sifA基因缺失沒(méi)有改變其生長(zhǎng)速度。

圖6 C50041、C50041ΔsifA和C50041ΔsifAΔspiC的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves of C50041, C50041ΔsifA and C50041ΔsifAΔspiC

2.2.2C50041ΔsifA的生化特性 通過(guò)API 20E生化鑒定卡進(jìn)行生化鑒定，鑒定了半乳糖苷酶(ONPE)(-)，精氨酸雙水解酶(ADH)(-)，尿素酶(URE)(-)，色氨酸脫氨酶(TDA)(-)，吲哚產(chǎn)生(IND)(-)，乙酰甲基甲醇(VP)(-)，明膠酶(GEL)(-)，肌醇發(fā)酵(INO)(-)，蔗糖發(fā)酵(SAC)(-)，苦杏仁苷發(fā)酵(AMY)(-)，賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)(LDC)(+)，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)(+)，檸檬酸利用(CIT)(+)，硫化氫產(chǎn)生(H2S)(+)，葡萄糖發(fā)酵(GLU)(+)，甘露醇發(fā)酵(MAN)(+)，山梨醇發(fā)酵(SOR)(+)，鼠李糖發(fā)酵(RHA)(+)，密二糖發(fā)酵(MEL)(+)，阿拉伯糖發(fā)酵(ARA)(+)等20個(gè)生化特性，C50041、C50041ΔsifA和C50041-ΔsifAΔspiC的這些生化特性完全一致，所以sifA基因的缺失未改變腸炎沙門菌的生化特性。(“+”代表陽(yáng)性，“-”代表陰性)。

2.3C50041ΔsifA在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖情況 分別取增殖的第0 h、8.5 h和24 h的時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞裂解后進(jìn)行胞內(nèi)沙門菌計(jì)數(shù)，以0 h的細(xì)菌數(shù)量為初始值，比較胞內(nèi)沙門菌的增長(zhǎng)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)spiC的缺失提高腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力(t=28.64,P<0.001)，sifA的缺失降低腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)增殖能力(ΔsifAvsWT,t=3.077,P<0.05；ΔspiCvsΔspiCΔsifA(t=29.66,P<0.001)。結(jié)果如圖7。

圖7 腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖情況Fig.7 The proliferation of intracellular SE strains

2.4腸炎沙門菌sifA基因的表達(dá)情況

2.4.1sifA基因在胞外沙門菌中表達(dá) 提取細(xì)菌mRNA并反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行熒光定量PCR，將野生株C50041的sifA基因的表達(dá)量設(shè)置為1，結(jié)果顯示sifA基因在spiC缺失株中表達(dá)量顯著上升(t=4.432,P<0.05)。結(jié)果如圖8。

圖8 LB培養(yǎng)腸炎沙門菌sifA基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8 mRNA level of sifA gene of SE in the LB media by qPCR

2.4.2sifA基因在胞內(nèi)沙門菌中表達(dá) 選取細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖1 h、8.5 h和19 h的時(shí)間點(diǎn)提取mRNA反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果同樣證明spiC基因缺失能上調(diào)sifA基因的表達(dá)，尤其是在沙門菌感染巨噬細(xì)胞8.5 h和19 h顯著上升(t=29.80,P<0.01)(t=6.007,P<0.01)。結(jié)果如圖9。

圖9 感染巨噬細(xì)胞中腸炎沙門菌sifA基因表達(dá)量Fig.9 mRNA level of sifA gene of SE in macrophage by qPCR

3 討 論

沙門菌是一種重要的人獸共患病病原菌，嚴(yán)重危害動(dòng)物，威脅人的健康，是引起突發(fā)性食物中毒事件的重要病原菌之一，也是導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)最主要的原因[14]。2013年，27個(gè)歐盟(EU)成員國(guó)報(bào)告了82 694例沙門菌病例，每10萬(wàn)人有20.4例感染者。其中兩種最常見(jiàn)的沙門菌血清型是腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌，分別占所有報(bào)告與確診人類病例相關(guān)的血清型的39.5%和20.2%，腸炎沙門菌感染病例超越了鼠傷寒沙門菌[15]。在我國(guó)腸炎沙門菌也是引起沙門菌食物中毒最常見(jiàn)的血清型之一[16]。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于腸炎沙門菌致病機(jī)制的研究較少，其致病機(jī)制主要參照模式菌—鼠傷寒沙門菌。

在鼠傷寒沙門菌致病機(jī)制研究中，沙門菌進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，能有效躲避細(xì)胞的殺菌作用，然后在細(xì)胞內(nèi)生存繁殖，這是導(dǎo)致其持續(xù)感染和免疫逃逸的一個(gè)重要原因。

沙門菌侵入宿主細(xì)胞后，能重塑宿主細(xì)胞內(nèi)吞區(qū)室而形成一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)—沙門菌囊泡，沙門菌在SCV內(nèi)生存并復(fù)制，使沙門菌可以獲得宿主的膜和所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能保護(hù)病原菌免受細(xì)胞溶質(zhì)殺菌應(yīng)激反應(yīng)的影響，確保其在細(xì)胞內(nèi)正常生存和復(fù)制[9]。

沙門菌侵入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖是由多個(gè)沙門菌毒力島(SPI)介導(dǎo)完成的，其中SPI1和SPI2是最重要的，分別表達(dá)III型分泌系統(tǒng)T3SS1和T3SS2，它們作為分子注射器能將40多種效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞胞質(zhì)中[5]。當(dāng)沙門菌接觸到細(xì)胞膜時(shí)，T3SS1分泌效應(yīng)蛋白能作用于宿主細(xì)胞質(zhì)膜而引起細(xì)胞骨架的重排，使細(xì)菌侵襲進(jìn)入細(xì)胞[17]；沙門菌進(jìn)入細(xì)胞后，通過(guò)修飾吞噬小體并改變吞噬小體的成熟過(guò)程形成SCV來(lái)保護(hù)自身不被降解。囊泡中沙門菌的T3SS2被激活分泌30多種作用于囊泡膜的效應(yīng)蛋白，來(lái)促進(jìn)SCV成熟、SIF形成和囊泡內(nèi)沙門菌復(fù)制。細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制開(kāi)始于感染細(xì)胞后的2～3 h，在這段時(shí)間里，沙門菌會(huì)不斷地調(diào)節(jié)SCV中的環(huán)境來(lái)使自己得以生存。

細(xì)胞中SCV的成熟過(guò)程同樣遵循內(nèi)體從早期至晚期的成熟途徑。SCV的形成可以分為3個(gè)階段：感染細(xì)胞后10～60 min為早期SCV形成，T3SS1效應(yīng)蛋白SopA、SopB/SigD、SipA/SspA、SopD和SopE參與；感染1～4 h時(shí)形成中期SCV，此過(guò)程不僅需要T3SS1效應(yīng)蛋白SipA和SopB的參與，還需要T3SS2效應(yīng)蛋白SifA、SseG和SseF的參與；感染4 h以后為SCV形成后期，T3SS2效應(yīng)蛋白PipB2、SifA、SifB、SopD2、SseF、SseG、SseJ和SpvB參與此過(guò)程[18]。SifA蛋白主要參與SCV形成的中晚期。

在SCV形成的早期階段表達(dá)的T3SS2效應(yīng)蛋白是SpiC，它是第一個(gè)被鑒定的T3SS2效應(yīng)蛋白，它在沙門菌感染細(xì)胞后的0.5～1 h內(nèi)表達(dá)，并可以抑制SCV與溶酶體的融合，它的缺失會(huì)明顯降低沙門菌的毒力[19]。SCV移動(dòng)至核區(qū)時(shí)即SCV形成中期，T3SS2的效應(yīng)蛋白SseG和SseF相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)晚期內(nèi)體再分配維持SCV的穩(wěn)定性并與SifA蛋白協(xié)同作用，改變SCV的運(yùn)輸路徑促使SCV進(jìn)入成熟期[20]。在SCV成熟期，SifA蛋白通過(guò)抑制甘露醇-6-磷酸受體的招募來(lái)阻止溶酶體對(duì)沙門菌的清除[7]，sifA基因缺失可明顯減弱沙門菌的毒力[21]。SifA蛋白的形成依賴于sifA基因，它通過(guò)與宿主蛋白SKIP相互作用，下調(diào)SCV對(duì)微管驅(qū)動(dòng)蛋白的招募，若sifA基因缺失則對(duì)SCV的形成造成影響，使沙門菌在細(xì)胞內(nèi)不能正常復(fù)制，所以sifA基因是影響沙門菌在細(xì)胞內(nèi)增殖的一個(gè)重要基因。

本研究利用同源重組的原理，通過(guò)一步法連接、顏色輔助篩選等改進(jìn)方法，構(gòu)建了腸炎沙門菌C50041株的sifA基因缺失株C50041ΔsifA、雙基因缺失株C50041ΔsifAΔspiC，該方法簡(jiǎn)化了沙門菌基因敲除過(guò)程，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。基因的無(wú)痕敲除則避免殘留堿基可能導(dǎo)致的不可預(yù)期的結(jié)果。各菌株的生長(zhǎng)生化特性保持一致，表明sifA基因的缺失對(duì)其生物學(xué)特性并無(wú)影響。腸炎沙門菌在鼠源巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖的結(jié)果表明，與野生株相比，sifA基因缺失株巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門菌的數(shù)量顯著減少，并且能降低C50041ΔspiC在細(xì)胞內(nèi)的增殖量，這說(shuō)明sifA基因缺失能有效降低胞內(nèi)沙門菌的增殖。通過(guò)熒光定量PCR結(jié)果顯示無(wú)論是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，spiC基因缺失后sifA基因的表達(dá)量上調(diào)，可能導(dǎo)致產(chǎn)生更多的SCV絲狀物，以吸收更多的營(yíng)養(yǎng)[22]，該結(jié)果部分解釋了腸炎沙門菌spiC基因缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)超級(jí)復(fù)制增殖的現(xiàn)象。該研究為進(jìn)一步研究腸炎沙門菌sifA基因功能及SCV的形成規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)