鮑曉穎，龐溦，潘連德、2*，張曉雨

(1.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306)

龜類(lèi)作為觀(guān)賞寵物歷史悠久，飼養(yǎng)的寵物龜患有“灰白甲”病癥較為常見(jiàn)，雖然病龜活動(dòng)及攝食基本正常，但因病因和病理不清，目前尚無(wú)根治辦法，病龜背甲或腹甲的灰白色病變嚴(yán)重時(shí)就會(huì)危及生命，且降低了寵物龜?shù)挠^(guān)賞價(jià)值，一些名貴品種還會(huì)因此造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

龜類(lèi)甲殼出現(xiàn)病變的情況常發(fā)生在巴西龜Trachemysscriptaelegans[1-2]、火焰龜Pseudemysconcinna[1]、甜甜圈龜Pseudemysconcinna[2]、地圖龜Graptemysspp.[3]、沙漠陸龜Gopherusagassizii[4]等龜種，病龜?shù)呐R床癥狀為甲殼病變處出現(xiàn)淺褐色凹陷或凸起、骨骼變軟、灰白色及橙色等顏色破損、形狀和質(zhì)地的改變，所表現(xiàn)出的共同病理特征為病灶處廣泛的骨重建[1-2，4]、嗜酸性粒細(xì)胞[2-3]和異嗜白細(xì)胞[4]等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的全身性炎癥表現(xiàn)。目前，引起巴西龜[1]、火焰龜Pseudemysconcinna[1]、沙漠陸龜Gopherusagassizii[4]、黃喉擬水龜Mauremysmutica[5-6]、平背麝香龜Sternotherusdepressus[7]、亞達(dá)伯拉龜Geochelonegigantea[8-9]、加拉帕戈斯龜Chelonoidisnigramicrophyes[10]、德州地鼠龜Gopherusberlandieri[11]等甲殼疾病的細(xì)菌[4-6，8-9，12]、真菌[9-11]、寄生蟲(chóng)[1]、水體毒素[7]等病原學(xué)和病因的研究，為龜類(lèi)甲殼病相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。但對(duì)龜類(lèi)患“灰白甲”病的研究極少，僅見(jiàn)甲殼角化不良癥的沙漠陸龜[4]和甲殼鐮刀菌感染癥的德州地鼠龜[11]等兩種陸生龜類(lèi)的研究報(bào)道，尚未見(jiàn)水生龜類(lèi)的相關(guān)報(bào)道。本研究中，對(duì)患“灰白甲”病的3種水生寵物龜6個(gè)病例進(jìn)行了器官病理和組織病理學(xué)觀(guān)察比較，旨在為該類(lèi)疾病的病因分析和發(fā)病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，并為臨床診斷和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年9月，收集家庭飼養(yǎng)的具有灰白甲癥狀的各種寵物龜若干只于上海海洋大學(xué)大學(xué)水族寵物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，從中選擇癥狀典型的2只巴西龜(1號(hào)，背甲長(zhǎng)為7.7 cm，體質(zhì)量為0.09 kg，雌性；2號(hào)，背甲長(zhǎng)為9.7 cm，體質(zhì)量為0.15 kg，雄性)，2只中華草龜(3號(hào)，背甲長(zhǎng)為6 cm，體質(zhì)量為0.048 kg，雄性；4號(hào)，背甲長(zhǎng)為15 cm，體質(zhì)量為0.626 kg，雌性)，2只黃頭側(cè)頸龜(5號(hào)，背甲長(zhǎng)為14 cm，體質(zhì)量為0.402 kg，雌性；6號(hào)，背甲長(zhǎng)為13.2 cm，體質(zhì)量為0.346 kg，雌性)。集中飼養(yǎng)在長(zhǎng)×寬為120 cm×40 cm、深度為8～10 cm的帶有過(guò)濾裝置的室內(nèi)龜缸中，穩(wěn)定水溫為27～29 ℃，用龜糧(Hikari)和鮮蝦肉飼喂。正式試驗(yàn)時(shí)禁食。試驗(yàn)龜編號(hào)(1～6號(hào))通過(guò)留下與托盤(pán)上數(shù)字代碼的合照影像識(shí)別，并進(jìn)行臨床體檢以確定性別和健康狀況，排除患有其他疾病的試驗(yàn)龜。將其中3只龜(1號(hào)、4號(hào)、5號(hào))作為組織病理試驗(yàn)用龜，將另外3只龜(2號(hào)、3號(hào)、6號(hào))作為活體龜背甲采樣試驗(yàn)用龜。

1.2 方法

1.2.1 3種病龜?shù)呐R床癥狀與病理解剖觀(guān)察 試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)評(píng)估每只病龜背甲和腹甲病變的范圍，通過(guò)肉眼觀(guān)察和暗室伍德燈(七外光品牌，008號(hào)，5顆燈珠)下觀(guān)察，加以驗(yàn)證，取巴西龜1號(hào)、中華草龜4號(hào)和黃頭側(cè)頸龜5號(hào)進(jìn)行臨床癥狀觀(guān)察和病理解剖，記錄龜體表和臟器的病理變化，以確定病變部位或器官。試驗(yàn)龜干露濕身和干身狀態(tài)時(shí)，分別采集圖片，做出3種病龜臨床癥狀和病理解剖特征描述和診斷。

1.2.2 3種病龜組織病理制片和觀(guān)察 將巴西龜1號(hào)、中華草龜4號(hào)、黃頭側(cè)頸龜5號(hào)肌肉注射舒泰25 mg/kg 進(jìn)行麻醉[13]，用沖擊電鉆(歐萊德)進(jìn)行直徑1 cm的龜甲全厚度取樣，在EDTA脫鈣液中脫鈣20 d。取龜甲樣品后解剖，取病龜?shù)男摹⒏?、脾、肺、腎、腸道和胰腺等重要臟器，切成約5 mm組織塊，置于10%中性甲醛中固定24 h后，沖水5 h。用體積分?jǐn)?shù)為50%～100%的乙醇溶液對(duì)試驗(yàn)龜甲和組織塊逐級(jí)脫水，透明。于56～58 ℃下用石蠟包埋，切片厚度為5～7 μm，并于60 ℃下烘片1 h，用Masson三色法和Perls blue法對(duì)試驗(yàn)龜甲染色，用H.E法對(duì)試驗(yàn)龜甲及其重要臟器組織染色，中性樹(shù)膠封片，于徠卡DM3000顯微鏡下觀(guān)察、拍照。

1.2.3 活體龜背甲可恢復(fù)采樣方法 將巴西龜2號(hào)、中華草龜3號(hào)、黃頭側(cè)頸龜6號(hào)肌肉注射舒泰25 mg/kg 進(jìn)行麻醉[13]，在病龜背甲病灶確定采樣位置，用酒精消毒，使用沖擊電鉆(歐萊德)環(huán)形直徑1 cm的鉆頭，進(jìn)行龜甲全厚度取樣(圖1-A)。取得樣品后的創(chuàng)傷空洞, 用牙科樹(shù)脂(靚雅)密封[3，9，14]，用0.9%無(wú)菌生理鹽水沖洗,將EDTA溶液涂抹創(chuàng)面，涂上酸蝕劑(杭州西湖巴爾)15 s后用生理鹽水清洗，再將黏結(jié)劑(杭州西湖巴爾)涂抹于整個(gè)洞壁(圖1-B),直接涂抹第二層黏結(jié)劑，15 s后輕吹約2 s,用標(biāo)準(zhǔn)光固化燈(靚雅)光照20 s使牙科樹(shù)脂固化,進(jìn)行空洞填充(圖1-C)。采樣完畢的試驗(yàn)龜干養(yǎng)24 h后，將其移至室內(nèi)龜缸中，后腿基部肌肉注射硫酸慶大霉素注射液(山西省芮城科龍獸藥)，劑量為40 mg/kg體質(zhì)量，每隔24 h 注射一次，共注射7次。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種病龜?shù)呐R床癥狀與病理解剖特征

2.1.1 3種病龜?shù)呐R床癥狀及其比較 3種病龜患病后活動(dòng)、攝食情況未見(jiàn)異常，除背腹面甲殼表面產(chǎn)生部分或全部 “灰白甲”病變的臨床癥狀外，體表、四肢和頭頸均未見(jiàn)其他異常(圖2)。3種病龜早期癥狀為背甲上出現(xiàn)零星灰白色點(diǎn)狀病灶，隨著病情的發(fā)展，背甲零星白點(diǎn)病灶連成大的白斑病灶(圖2-B)，繼續(xù)發(fā)展背甲小部分或一半(圖2-C)變成灰白色病灶，最終達(dá)到整個(gè)背甲或腹甲形成灰白色病灶(圖2-A)。背甲灰白色病灶質(zhì)地粗糙，角質(zhì)片易剝落(圖2-A)。在黑暗環(huán)境中，用伍德燈照射3種病龜背部和腹部，灰白色病灶產(chǎn)生明顯的熒光現(xiàn)象(圖3)，未病變部分未出現(xiàn)熒光現(xiàn)象(圖3-C)，巴西龜(圖3-A)和黃頭側(cè)頸龜(圖3-C)的甲片接縫間(生長(zhǎng)紋)都未產(chǎn)生病變，而中華草龜病變明顯(圖3-B)。伍德燈檢驗(yàn)與肉眼觀(guān)察一致且更加清晰準(zhǔn)確，適合臨床檢查診斷。3種病龜?shù)谋臣捉员雀辜撞∽冊(cè)缜腋鼮槊黠@。

2.1.2 3種病龜?shù)牟±斫馄侍卣骷捌浔容^ 臨床解剖觀(guān)察可見(jiàn)，1號(hào)和4號(hào)病龜脂肪塊呈黑色(圖4-A、B)，4號(hào)和5號(hào)病龜肝呈黑褐色顏色異常、體積腫大(圖4-B、C、E、F)，1號(hào)病龜肝呈黃褐色顏色異常(圖4-A、D),4號(hào)病龜肝臟上有白色結(jié)節(jié)、脾腫大(圖4-E)，其他器官未見(jiàn)明顯異常。

2.2 3種病龜背甲病變及其比較

2.2.1 3種病龜背甲全厚度橫切面的基本結(jié)構(gòu) 龜背甲由角質(zhì)層、密質(zhì)層和松質(zhì)層構(gòu)成(圖5-A、D)，Masson三色染色的2號(hào)巴西(圖5-A)、3號(hào)中華草龜(圖5-B)和6號(hào)黃頭側(cè)頸龜(圖5-C)背甲分層比H.E染色(圖5-D、E、F)更清晰?？梢?jiàn)，水生龜類(lèi)的背甲結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由外向內(nèi)分別為角質(zhì)層、表皮層、真皮層、骨髓腔、骨小梁、骨內(nèi)膜、骨外膜等層狀結(jié)構(gòu)(圖5-B、E、C、F)。

2.2.2 3種病龜背甲全厚度橫切面病理變化 病龜背甲全厚度橫切面角質(zhì)層的膠原纖維結(jié)構(gòu)稀疏、變形、壞死碎裂和脫落，在2號(hào)巴西龜(圖6-A)、3號(hào)中華草龜(圖6-B)、6號(hào)黃頭側(cè)頸龜(圖6-C)中均有表現(xiàn), 其中，2號(hào)巴西龜(圖6-D)、3號(hào)中華草龜(圖6-E)和6號(hào)黃頭側(cè)頸龜(圖6-F)背甲各層中均分布大量黑色素，為“灰白甲”癥狀提供了組織病理佐證。背甲松質(zhì)骨層骨髓腔浸潤(rùn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞及大量黑色素沉積(圖6-G、H、I)，松質(zhì)骨層骨髓腔浸潤(rùn)的嗜酸性粒細(xì)胞明顯(圖6-J、K、L)，為灰白甲癥狀提供了組織炎癥的病理佐證。

2.2.3 3種病龜背甲全厚度縱切面H.E染色病理結(jié)果 3種病龜背甲松質(zhì)骨層骨髓腔浸潤(rùn)存在大量的嗜酸性粒細(xì)胞及黑色素沉積(圖7-A、B、C)。背甲表皮層、真皮層和密質(zhì)骨層中存在黑色素，6號(hào)黃頭側(cè)頸龜分布最多(圖7-I)，其次是2號(hào)巴西龜(圖7-D、G)和3號(hào)中華草龜(圖7-H、K)。

2.2.4 3種病龜背甲全厚度縱切面Perls blue染色結(jié)果 2號(hào)巴西龜松質(zhì)骨層骨髓腔中存在大量黑色素細(xì)胞(圖7-J), 3號(hào)中華草龜真皮層中存在大量黑色素細(xì)胞(圖7-K),6號(hào)黃頭側(cè)頸龜松質(zhì)骨層骨髓腔中也存在大量黑色素細(xì)胞(圖7-L),但均未見(jiàn)含鐵血黃素。

2.3 3種病龜主要組織器官的病變及其比較

3種病龜?shù)钠⒔M織都出現(xiàn)了嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的明顯炎癥(圖8-A、B、C)。1號(hào)巴西龜?shù)囊认俪霈F(xiàn)管壁增厚病變(圖8-D)，其他無(wú)異常(圖8-E、F)。1號(hào)巴西龜?shù)哪I組織出現(xiàn)顆粒變性(圖8-G)，4號(hào)中華草龜?shù)哪I小管空泡化(圖8-H)，5號(hào)黃頭側(cè)頸龜腎小管擴(kuò)張病變，局部有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖8-I)。3種病龜?shù)母谓M織都出現(xiàn)了大量黑色素(圖8-J、L)，4號(hào)中華草龜?shù)母谓M織出現(xiàn)肉芽腫和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖8-K)。3種病龜?shù)男摹⒎?、腸組織組織結(jié)構(gòu)一致，均未見(jiàn)異常。

2.4 活體龜背甲可恢復(fù)采樣結(jié)果

2號(hào)巴西龜、3號(hào)中華草龜、6號(hào)黃頭側(cè)頸龜用沖擊鉆取樣后的創(chuàng)口處置和結(jié)果相同，如2號(hào)巴西龜?shù)膭?chuàng)口(圖9-A)，經(jīng)牙科樹(shù)脂封閉(圖9-B)和后腿基部肌肉注射硫酸慶大霉素治療后，歷經(jīng)兩個(gè)月恢復(fù)期，試驗(yàn)龜背甲創(chuàng)口長(zhǎng)出新生組織且完全愈合(圖9-C)，封閉物脫落。3只病龜創(chuàng)口均康復(fù)，攝食和活動(dòng)均正常。

3 討論

3.1 寵物龜 “灰白甲”病的組織病理學(xué)診斷

水生寵物龜“灰白甲”病的病例十分常見(jiàn),在干露狀態(tài)下肉眼觀(guān)察到龜?shù)谋臣谆蚋辜子谢野咨邏K，或整個(gè)龜甲灰白色明顯而一致的臨床癥狀，再用伍德燈照射有熒光現(xiàn)象，可以做出初步診斷。依據(jù)“灰白甲”病的寵龜背甲病變處出現(xiàn)角蛋白纖維的壞死和碎裂，以及骨髓腔內(nèi)和脾組織出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等組織病理特征,就可以做出準(zhǔn)確診斷。

由此可見(jiàn)，病龜龜甲呈灰白色為角蛋白纖維的壞死和碎裂造成的表面粗糙。觀(guān)察比較干露濕身和干身狀態(tài)下灰白甲癥狀，干露干身狀態(tài)比濕身狀態(tài)灰白色更為明顯，亦可佐證這一點(diǎn)，故臨床癥狀結(jié)果全部采用干露干身圖片。

患 “灰白甲”病的3種水生寵物龜?shù)呐R床癥狀和甲殼病理變化與美國(guó)加利福尼亞州的莫哈韋沙漠、科羅拉多沙漠中的沙漠陸龜?shù)募讱そ腔涣及Y[4]，以及美國(guó)德克薩斯州南部的德州地鼠龜?shù)募讱ょ牭毒腥景Y[10]相似，因上述文獻(xiàn)缺乏器官組織病理研究結(jié)果，而無(wú)法比較?！盎野准住辈∨c巴西龜[1-2]、火焰龜[1]、甜甜圈龜[2]、地圖龜[3]的殼病，黃喉擬水龜?shù)母瘹げ5]與體表潰瘍[6]，平背麝香龜[7]及亞達(dá)伯拉龜中擬青霉引起的肥厚菌病[8]，真空輔助閉合治療烏龜深部膿腫和骨髓炎[9]，以及加拉帕戈斯龜甲殼病[10]的臨床癥狀和組織病理特征不同。內(nèi)臟組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的組織病理特征在養(yǎng)殖菱斑龜代謝性肝病[15]和中華草龜恩諾沙星中毒癥[16]中均有提到。脾是龜重要的免疫器官，脾中不正常的高嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量與寄生蟲(chóng)感染(如原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng))或其他的抗原刺激有關(guān)[17]。

本研究中還采集了患“灰白甲”病的巴西龜、中華草龜、黃頭側(cè)頸龜?shù)牟≡罱M織和附著物，制作水浸片、棉蘭染色、碘酊染色，光學(xué)顯微鏡檢查均未發(fā)現(xiàn)致病性藻類(lèi)、寄生蟲(chóng)、真菌等病原；病灶分離了若干優(yōu)勢(shì)菌株，以繼續(xù)進(jìn)行病原學(xué)研究。養(yǎng)殖環(huán)境(水硬度、pH和水質(zhì)指標(biāo)的變化)及其微生物也可能是發(fā)病原因。該病的病原(病因)有待進(jìn)一步研究。

3.2 伍德燈和牙科樹(shù)脂在龜殼病診斷和治療上的應(yīng)用

伍德燈是人類(lèi)和寵物皮膚科臨床檢查的一種輔助診斷工具[18]，本研究中用于寵物龜“灰白甲”病的臨床檢驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)崿F(xiàn)無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的臨床效果，并彌補(bǔ)肉眼難以確定的寵物龜“灰白甲”病癥狀及其他一些皮膚病。

3種龜龜甲皆由骨質(zhì)板及覆蓋于骨質(zhì)板外的角質(zhì)盾所構(gòu)成[19]，龜殼骨質(zhì)板與動(dòng)物骨骼結(jié)構(gòu)相似，分為密質(zhì)層和松質(zhì)層兩部分[20-21]。寵物龜使用沖擊電鉆進(jìn)行的龜甲全厚度取樣，取得樣品后的創(chuàng)傷空洞, 用牙科樹(shù)脂(甲基丙烯酸甲酯)密封，這種活體龜背甲可恢復(fù)采樣方法非常適用，可用于甲殼疾病和創(chuàng)傷的臨床治療[3，9，14]。

3.3 寵物龜“灰白甲”病的病理機(jī)制及其危害

本試驗(yàn)中的巴西龜、中華草龜、黃頭側(cè)頸龜?shù)?種水生寵物龜6只患“灰白甲”病的病龜，具有共同臨床癥狀和組織病理特征，3種龜脾、腎組織和背甲骨髓腔均浸潤(rùn)大量嗜酸性粒細(xì)胞炎癥及呈現(xiàn)大量黑色素沉積的特征，說(shuō)明3種龜患“灰白甲”病的病因和病理機(jī)制相同?！盎野准住辈〉陌l(fā)展慢、病程長(zhǎng)，逐漸蔓延到整個(gè)背甲和腹甲后，降低或失去了寵物龜?shù)挠^(guān)賞價(jià)值，從病龜重要組織的大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和黑色素沉積的病理結(jié)果也揭示了對(duì)龜?shù)慕】滴：Α?/p>