李菊芬，林 濤，馬國斌

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106)

細(xì)菌性果斑病(Bacteiral fruit blotch，簡(jiǎn)稱BFB)是一種嚴(yán)重危害葫蘆科植物的世界性病害，其病原為西瓜嗜酸菌(Acidovorascitrulli)[1]，是一種活體營養(yǎng)型細(xì)菌，屬于革蘭氏染色陰性菌。近些年，隨著我國瓜類作物種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，果斑病時(shí)有發(fā)生，曾給部分瓜類產(chǎn)區(qū)造成過較大損失。該病已被列為我國對(duì)內(nèi)、對(duì)外的植物檢疫性病害。瓜類細(xì)菌性果斑病為典型的種傳細(xì)菌性病害[2]，建立一套快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。目前，隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外已有許多應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)西瓜、甜瓜種子細(xì)菌性果斑病菌的相關(guān)報(bào)道[3-5]。在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上，免疫富集PCR[6-7]、免疫磁性分離PCR[8-9]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[10-13]等方法的應(yīng)用大大提高了檢測(cè)的靈敏度，但這些方法操作程序復(fù)雜、前期準(zhǔn)備工作量大、所需儀器、試劑較為昂貴，不適合一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速檢測(cè)。本研究在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行篩選優(yōu)化，以期形成一套簡(jiǎn)單實(shí)用，并能在甜瓜種子實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的果斑病菌快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜(CucumismeloL.)種子：新疆繁育的自然攜帶瓜類細(xì)菌性果斑病菌的甜瓜種子。供試菌株：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所提供的細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株(Acidovorasavenaesubsp.citrulli，簡(jiǎn)稱Ac)。

1.2 試劑與儀器

普通PCR所需試劑均購于天根生化科技(北京)有限公司。PCR儀為BIO-Rad T100TMThermal Cycler。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用日本TaKaRa公司的SYBR green熒光染料，儀器為Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR System。使用核算蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad)測(cè)定OD600 nm值。

1.3 引物篩選

選用3對(duì)特異引物BX-L1BX-S-R2[4]、HB2F2HB2R2[5]和SEQID4mSEQID5[3]分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及PCR反應(yīng)條件(略有改動(dòng))詳見表1。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×buffer 2.5 μL，MgCl22 mmolL，dNTPs 0.2 mmolL，Taq DNA 聚合酶 1 U，正反向引物各0.2 μmolL，模板為1 μL種子提取液，無菌三蒸水補(bǔ)齊。以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察并拍照。

表1 檢測(cè)細(xì)菌性果斑病菌的3對(duì)特異引物及PCR擴(kuò)增條件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系按照TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行，擴(kuò)增程序采用Bio-Rad CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀默認(rèn)程序，即95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s， 40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。

Acidovorasavenaesubsp.Citrulli菌株接種在液體KB培養(yǎng)基[14]中，28℃、220rmin振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，加入1mL無菌水至懸浮狀態(tài)，根據(jù)測(cè)得的OD600 nm值，用無菌水分別配成1×107CFUmL、1×106CFUmL、1×105CFUmL、1×104CFUmL、1×103CFUmL、1×102CFUmL 6個(gè)濃度梯度的菌懸液。以不同濃度的菌懸液為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)Ct值繪制每對(duì)特異引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 種子的不同處理方式

分別取帶菌種子100粒，進(jìn)行以下3種處理。處理A：完整種子直接放入滅菌三角瓶中。處理B：種子去殼后，將種殼和種仁一起放入滅菌三角瓶中。處理C：將種子放入滅菌研缽中研磨至粉碎后，移入滅菌三角瓶中。分別向三角瓶中加入10mL滅菌雙蒸水，于28℃、220rmin搖培12h，取1 μL提取液作為PCR模板，以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽性對(duì)照，分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。各處理重復(fù)3次。

1.5 不同的提取液處理

分別取帶菌種子100粒放入滅菌三角瓶中，進(jìn)行以下不同處理。處理a：加入10mL滅菌雙蒸水。處理b：加入10mL 磷酸緩沖液(PBS Buffer；137 mmolL NaCl，2.7 mmolL KCl，10 mmolL Na2HPO4∶2H2O，2mmolL KH2PO4)。處理c：加入10mL KB液體培養(yǎng)基。將三角瓶于28℃、220rmin搖培12h，取1 μL提取液作為PCR模板，以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽性對(duì)照，分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。各處理重復(fù)3次。

1.6 不同的提取時(shí)間處理

取帶菌種子100粒放入滅菌三角瓶中，加入10mL滅菌雙蒸水，于28℃、220rmin分別振蕩培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24h，取1 μL提取液作為PCR模板，以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽性對(duì)照，分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。各處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

普通PCR擴(kuò)增結(jié)果表明(圖1)，3對(duì)特異引物均能擴(kuò)出各自的特異條帶，均可用于檢測(cè)甜瓜種子攜帶的果斑病菌。但經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)綜合比較發(fā)現(xiàn)：引物HB2F2HB2R2的擴(kuò)增產(chǎn)物易形成二聚體；引物SEQID4mSEQID5擴(kuò)增的特異條帶亮度較弱；引物BX-L1BX-S-R2的擴(kuò)增產(chǎn)物不易形成二聚體，且條帶較亮，效果相對(duì)較佳，因此后續(xù)試驗(yàn)的普通PCR擴(kuò)增均采用此引物。

以1×102—1×107CFUmL 6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液為模板，分別用3對(duì)特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，引物SEQID4mSEQID5在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌液的實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，檢測(cè)到的Ct值與相應(yīng)菌液濃度的對(duì)數(shù)值呈較好的線性相關(guān)(R2=0.9917)(圖2)，而且PCR產(chǎn)物的特異性好，熔解曲線顯示產(chǎn)物只有特異性的一個(gè)峰(圖3)。對(duì)引物HB2F2HB2R2和引物BX-L1BX-S-R2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，未獲得特異性單峰，且Ct值與菌液濃度的對(duì)數(shù)值沒有很好的線性相關(guān)。綜上結(jié)果，引物SEQID4mSEQID5適合用于Ac的菌落實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，因此后續(xù)試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR均采用該引物。

2.2 不同種子處理方式對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

帶菌甜瓜種子經(jīng)過3種不同方式處理后，其PCR檢測(cè)結(jié)果也有所不同。由圖4可以看出，以處理C為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增出特異條帶(279bp)。而處理A和處理B均能擴(kuò)增出目的條帶，且條帶亮度差異不明顯，處理A較B稍亮。但處理A無需研磨或去殼，操作簡(jiǎn)便。綜上比較可知,處理A，即以完整帶菌種子直接加水搖培后得到的提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，效果相對(duì)較佳。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：3種不同處理方式中，以完整種子浸提液為模板檢測(cè)到的Ac濃度最高，“種殼+種仁”處理次之，而以磨碎種子浸提液為模板，則無檢測(cè)數(shù)據(jù)。這與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3 不同提取液對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

帶菌甜瓜種子用3種不同的浸提液提取后，其PCR檢測(cè)結(jié)果差異較大(圖5)。處理c PCR擴(kuò)增后無特異條帶(279bp)出現(xiàn)。處理a和處理b均可擴(kuò)增出目的條帶，但處理a的條帶較亮，檢測(cè)效果最佳。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明：以無菌水為浸提液檢測(cè)到的Ac濃度最高，PBS為浸提液次之，以液體KB培養(yǎng)基為浸提液，則無檢測(cè)數(shù)據(jù)。這與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.4 不同提取時(shí)間對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

如圖6所示，帶菌甜瓜種子加無菌水分別搖培3 h、6 h、12h后，PCR均能擴(kuò)增出明顯的特異條帶(279bp)；但搖培24h時(shí)，則無目的條帶出現(xiàn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：經(jīng)3h、6h和12h搖培處理后，均能檢測(cè)到較高的Ac含量，而搖培24h，則無檢測(cè)數(shù)據(jù)。這與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果一致，表明搖培時(shí)間在3—12h為宜，至24h后，檢測(cè)結(jié)果受到極大影響。

3 討論

在傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)甜瓜種子細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè)方法進(jìn)行了篩選優(yōu)化。任毓忠等[15]研究表明，種皮的帶菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于種仁。為了獲得帶菌量較多的浸提液模板，本研究對(duì)帶菌種子進(jìn)行了不同處理。結(jié)果表明，處理A(完整帶菌種子加水搖培)和處理B(帶菌種子去殼后，種殼和種仁一起加水搖培)均能通過PCR擴(kuò)增出目的條帶，條帶亮度差異不明顯，其實(shí)時(shí)熒光定量PCR均能檢測(cè)到較高的Ac濃度。這說明用完整種子搖培后浸提液中的帶菌量和種殼+種仁搖培后的帶菌量接近，表明細(xì)菌性果斑病菌主要附著在種子表皮，這與任毓忠等[15]的研究結(jié)果一致。處理C(以磨碎種子浸提液為模板)的PCR擴(kuò)增效果較差，可能是由于種子研碎后，大量蛋白、油脂等雜質(zhì)混入浸提液，嚴(yán)重影響了PCR的擴(kuò)增效率。綜合比較，可直接用完整種子進(jìn)行搖培檢測(cè)。

本研究表明，帶菌甜瓜種子經(jīng)搖培3—12h，其PCR檢測(cè)結(jié)果基本不受影響，均能擴(kuò)增出明顯的目的條帶；但搖培至24h，卻無目的條帶出現(xiàn)。這可能與搖培24h后，部分甜瓜種子開始萌發(fā)，造成大量雜質(zhì)混入浸提液影響PCR結(jié)果有關(guān)，其原因有待于進(jìn)一步深入探討。

不同引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，引物BX-L1BX-S-R2的擴(kuò)增效果最佳。而杜艷媚等[16]參照Bahar等[4]的方法，以西瓜果斑病菌菌液為模板，BX-L1BX-S-R2引物卻不能擴(kuò)增出目的片段，這可能是由于國內(nèi)Taq DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich)等PCR試劑與國外不同，因此反應(yīng)條件也應(yīng)做相應(yīng)的改變，以獲得最佳結(jié)果。本試驗(yàn)對(duì)BX-L1BX-S-R2引物擴(kuò)增條件中的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，當(dāng)退火溫度降至60℃時(shí)，即可擴(kuò)增出明顯的目的條帶。而對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，引物SEQID4mSEQID5則是最佳選擇。因此對(duì)Ac進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選用相應(yīng)的引物。

綜上，本研究?jī)?yōu)化得到的PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，不需要提取細(xì)菌的DNA，只需將完整種子用無菌水搖培3h后，以浸提液為模板，即可擴(kuò)增出特異性的DNA片段。定性檢測(cè)時(shí)，應(yīng)首選引物BX-L1BX-S-R2進(jìn)行普通PCR即可；若需要精準(zhǔn)的定量檢測(cè)，則可選用引物SEQID4mSEQID5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。