王文杰，葛 雷，張樹山，吳彩風(fēng)，戴建軍，張德福*

(1 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海201106)

哺乳動物配子及胚胎冷凍保存在種質(zhì)資源保存和跨區(qū)域種質(zhì)資源交流上具有重要意義。近年來，玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但由于豬卵母細(xì)胞內(nèi)脂肪含量較高，對低溫較為敏感，極易受到低溫?fù)p傷，冷凍后發(fā)育能力與其他動物相比較低[1-2]。線粒體是哺乳動物卵母細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，是細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)的提供者和早期胚胎發(fā)育的唯一能量來源，在卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育中具有十分重要的作用。有研究表明，玻璃化冷凍破壞了人[3]和牛[4]卵母細(xì)胞線粒體功能，降低了ATP含量，這可能是導(dǎo)致冷凍保存后卵母細(xì)胞發(fā)育能力低下的原因之一[4]。氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡也被認(rèn)為是卵母細(xì)胞冷凍后活力下降的主要因素[5-6]。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ是一種特效作用于線粒體，通過降低線?；钚匝跛健p少氧化應(yīng)激來保護(hù)線粒體功能的抗氧化劑[7]。目前，線粒體靶向抗氧化劑MitoQ在豬卵母細(xì)胞冷凍保存應(yīng)用方面未見相關(guān)報道。本試驗在豬卵母細(xì)胞凍后孵育液中添加MitoQ，研究線粒體膜電位、氧化應(yīng)激水平、凋亡狀態(tài)、發(fā)育能力和相關(guān)基因表達(dá)水平，以期探討MitoQ對豬卵母細(xì)胞凍后發(fā)育的影響及可能的作用機理。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

常規(guī)生化試劑除特別說明外均購自美國Sigma Aldrich公司，培養(yǎng)液購自美國Gilbco公司。

1.2 豬卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)

在屠宰場采集新鮮豬卵巢，置于含有青鏈霉素的37℃生理鹽水中，于2 h內(nèi)運回實驗室。使用18號針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面直徑為2—6 mm的卵泡。在顯微鏡下選取胞質(zhì)均勻且至少有3層完整顆粒細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。COCs首先用臺式液清洗3次，再用TCM-199洗3次，然后置于四孔板中培養(yǎng)44 h。每60枚COCs置于500 μL體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)，體外成熟培養(yǎng)液為TCM-199加10%豬卵泡液(實驗室自制)，加入10 IUmL孕馬血清促性腺激素(寧波第三激素制品有限公司)，10%胎牛血清，10 IUmL雙抗，0.1 mgmL L-半胱氨酸和10 ngmL表皮生長因子。培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2及飽和濕度。成熟培養(yǎng)44 h后用0.1%透明質(zhì)酸酶消化，選擇形態(tài)均一且排出第一極體的豬卵母細(xì)胞用于冷凍保存。

1.3 玻璃化冷凍和解凍

豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍和解凍均在38.5℃的熱臺上進(jìn)行，具體方法參考吳彩鳳等[8]。先將豬卵母細(xì)胞在冷凍保護(hù)液I[7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲基亞砜(DMSO)+10%胎牛血清(FBS)]中平衡處理3—5 min，然后移入冷凍保護(hù)液II(17%EG+17%DMSO+10%FBS+0.4 molL蔗糖)中， 平衡15—20 s后用OPS裝載，并迅速投入液氮中保存。解凍時，將OPS管中的細(xì)胞置于含有0.5 mmolL蔗糖的培養(yǎng)液中平衡3—5 min，然后轉(zhuǎn)入含0.25 mmolL蔗糖的培養(yǎng)液中繼續(xù)平衡3—5 min，TCM-199洗3次。解凍后的對照組為在含有10%FBS的TCM-199孵育液中孵育2 h；MitoQ處理組為在含有200 nmolL MitoQ的孵育液中孵育2 h。

1.4 豬卵母細(xì)胞凍后存活率和孤雌發(fā)育能力的測定

豬卵母細(xì)胞凍后存活率采用FDA染色方法測定。將各處理組的卵母細(xì)胞置于5 mgmL FDA染色中38.5℃染色5 min，洗滌后于熒光顯微鏡(LSCM，Nikon，日本)下觀察拍照，發(fā)強綠色熒光視為存活。豬卵母細(xì)胞凍后體外發(fā)育能力采用孤雌激活法測定。處理好的豬卵母細(xì)胞在電激活液中洗3次，移入鋪滿激活液的激活槽，均勻排列，以1.2 kVcm的直流電壓激活30 μs。激活后的豬卵母細(xì)胞在PZM-3中洗3次，然后置于38.5℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在第2 天和第7天檢測卵裂率和囊胚率。

1.5 線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位ΔΨm檢測采用JC-1試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。豬卵母細(xì)胞在JC-1染液(含800 μL TCM-199和200 μL 5×染色液緩沖液)中避光38.5℃孵育20 min，染色緩沖液洗3次(保持染色緩沖液4℃)后置于共聚焦顯微鏡(LSCM，Nikon，日本)下觀察拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化，分別記錄綠色和紅色熒光信號強度，各豬卵母細(xì)胞紅色(RITC)和綠色(FITC)熒光強度的比值即為ΔΨm。

1.6 凋亡早期檢測

使用Annexin V-FITC試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)對豬卵母細(xì)胞進(jìn)行檢測。處理后的豬卵母細(xì)胞用TCM-199洗3次，然后移入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC染液的混合液中，室溫避光孵育10 min后移入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液和10 μL碘化丙啶染色液混合液中，冰浴避光10 min。TCM-199洗3次后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 活性氧(ROS)檢測

采用活性氧檢測試劑盒檢測。處理好的豬卵母細(xì)胞移入含有10 μmolL DCFH-DA的TCM-199中，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用TCM-199洗3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光顯微鏡下觀察拍照，使用Image-Pro Plus 6.0分析熒光強度。

1.8 脂質(zhì)氧化檢測(MDA)

采用脂質(zhì)氧化(MDA)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測。處理好的豬卵母細(xì)胞加入150 μL細(xì)胞裂解液，待裂解后，1 600g離心10 min，取100 μL上清加入到含有事先配好的200 μL MDA檢測工作液的離心管中，混勻后沸水浴加熱15 min，水浴冷卻至室溫，1 000g離心10 min。取200 μL上清加入到96孔板中，用酶標(biāo)儀在532 nm處測定吸光度。MDA值以μmolmg表示。

1.9 Pan-Caspase染色

Pan-Caspase原位熒光染色采用Promega(美國)公司試劑盒。將FITC-VAD-FMK用TCM-199 以1∶500稀釋配成染色液，處理好的豬卵母細(xì)胞置于染色液中孵育20 min，TCM-199洗3次，然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化，分析熒光強度值。

1.10 凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測

用一步法cDNA提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)提取試驗組和對照組豬卵母細(xì)胞(各240枚)的cDNA。參考NCB I中豬卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的cDNA序列設(shè)計引物，以GADPH為內(nèi)參基因。引物信息見表1，用SYBR Green I進(jìn)行熒光定量Real-time PCR。按TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)說明書配制20 μL反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板，0.4 μL Forward Primer(10 μmolL)，0.4 μL Reverse Primer(10 μmolL)，10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix，8.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序為94℃ 30s；94℃ 5 s，60℃(參照各引物最佳退火溫度而定)30 s，45個循環(huán)。所有樣品均3次重復(fù)。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算比較。

表1 qRT-PCR所用引物信息

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍后MitoQ處理對豬卵母細(xì)胞線粒體膜電位和凋亡水平的影響

凍后MitoQ處理組線粒體膜電位(0.66±0.06)與凍后對照組線粒體膜電位(0.47±0.05)相比顯著升高，表明MitoQ處理能提高凍后豬卵母細(xì)胞線粒體功能。MitoQ處理后豬卵母細(xì)胞早期凋亡比率(43.00±3.51%)和總Caspase熒光強度值(5.88±0.27)與對照組(55.33±1.45和8.03±0.51)相比顯著降低，表明MitoQ處理降低了冷凍后豬卵母細(xì)胞的凋亡水平。

圖1中紅色熒光與綠色熒光比值為線粒體膜電位，橙色熒光強度越高表示線粒體膜電位越高，MitoQ組復(fù)合通道下熒光強度高于對照組。圖2中卵母細(xì)胞呈綠色熒光，表明細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，冷凍后2個組均出現(xiàn)大量早期凋亡豬卵母細(xì)胞， MitoQ處理后凋亡下降明顯。圖3中熒光強度越高表示Pan-Caspase活性越高，MitoQ處理組豬卵母細(xì)胞熒光強度值顯著下降。以上結(jié)果表明，冷凍后豬卵母細(xì)胞進(jìn)行MitoQ處理提高了其線粒體功能，降低了其凋亡比例。

2.2 凍后MitoQ處理對豬卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

凍后MitoQ處理組豬卵母細(xì)胞的ROS水平(3.03±0.61)與對照組ROS水平(13.13±1.52)相比顯著降低；MitoQ處理豬卵母細(xì)胞的MDA含量(20.54±0.91)與對照組(26.78±0.54)相比亦顯著降低。由圖4可見，活性氧(ROS)含量與綠色熒光正相關(guān)，凍后MitoQ處理組的綠色熒光強度顯著低于對照組。上述結(jié)果表明，凍后豬卵母細(xì)胞孵育液中添加MitoQ可顯著降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

2.3 凍后MitoQ處理對豬卵母細(xì)胞存活和體外發(fā)育的影響

凍后MitoQ處理組豬卵母細(xì)胞的存活率(60.33%±1.86%)、卵裂率(28.82%±1.38%)、囊胚率(4.50%±0.48%)與對照組的存活率(47.67%±1.67%)、卵裂率(22.07%±1.07%)、囊胚率(2.20%±0.51%)相比均顯著提高，表明凍后MitoQ處理能顯著提高豬卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力。

2.4 線粒體功能和凋亡相關(guān)基因表達(dá)

如圖5所示，凍后添加MitoQ處理的豬卵母細(xì)胞與對照組相比，線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)基因CuZnSOD相對表達(dá)量顯著提升；線粒體功能相關(guān)基因Mfn2相對表達(dá)量顯著提升，DNM1相對表達(dá)量顯著下降；凋亡相關(guān)基因TNF-α、Bax相對表達(dá)量顯著下降，Bcl-2相對表達(dá)量顯著升高，表明凍后MitoQ處理能調(diào)控豬卵母細(xì)胞線粒體功能和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

3 討論

哺乳動物卵母細(xì)胞和早期胚胎中，線粒體作為極其重要的細(xì)胞器不僅產(chǎn)生ATP，還參與著許多重要的功能，如通過調(diào)控Ca2+、活性氧水平以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[9]。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ是由三苯基磷酸陽離子與輔酶Q10的苯醌部分通過一個十碳脂肪鏈共價結(jié)合而成，能夠通過降低線粒體氧化損傷保護(hù)線粒體，從而降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，抑制細(xì)胞凋亡[10]。在帕金森病模型中，MitoQ可提高神經(jīng)細(xì)胞的線粒體功能[7]。在人精子冷凍方面，劉麗等[11]發(fā)現(xiàn)MitoQ處理可改善精子氧化應(yīng)激水平，提高精子活力。本試驗在豬卵母細(xì)胞冷凍保存后孵育過程中添加200 nmolL MitoQ，顯著提高了其凍后存活率和孤雌激活胚胎的發(fā)育能力，與上述研究相似。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性現(xiàn)象之一，膜電位下降，線粒體的功能受到影響。線粒體在凋亡相關(guān)信號引導(dǎo)下，膜通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，釋放不同促凋亡因子，凋亡因子能夠活化凋亡蛋白酶Caspase，激活后的Caspase能夠促進(jìn)更多的凋亡因子活化，通過級聯(lián)反應(yīng)啟動凋亡程序。因此，線粒體膜電位和總Caspase熒光染色常被用于檢測細(xì)胞凋亡水平。磷脂酰絲氨酸(PS)正常情況下分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞早期凋亡時會由內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移至外側(cè)，裸露在細(xì)胞膜表面，常用Annexin V-FITC進(jìn)行早期凋亡檢測。本試驗表明，豬卵母細(xì)胞凍后MitoQ處理提高了線粒體膜電位水平，降低了Caspase活性和早期凋亡現(xiàn)象。這與Wani等[12]用MitoQ在小鼠腦組織中改善細(xì)胞凋亡水平的結(jié)果類似，也與Sun等[13]在肝癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致。

細(xì)胞冷凍后受到氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)生成大量的ROS是主要的氧化應(yīng)激損傷原因[14]。細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除正常情況下保持動態(tài)平衡，ROS過多時就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激使得細(xì)胞處于易損狀態(tài)，并且能夠產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，破壞生物膜和細(xì)胞的正常功能，降低酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞大分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA)氧化變性，抑制蛋白質(zhì)功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本試驗表明，凍后豬卵母細(xì)胞添加200 nmolL MitoQ能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，減少MDA形成，該結(jié)果與Kelso等[16]用MitoQ降低大鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的結(jié)果類似。這表明MitoQ能夠有效降低豬卵母細(xì)胞凍后氧化應(yīng)激水平，減少氧化應(yīng)激損傷。

冷凍損傷主要體現(xiàn)在對線粒體功能造成負(fù)面影響，并且啟動相關(guān)凋亡程序，線粒體受到損傷能夠誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體途徑的凋亡[17]。本試驗中，添加200 nmolL MitoQ處理凍后卵母細(xì)胞，與對照組相比，促凋亡相關(guān)基因Bax、TNF-α顯著降低，抑制凋亡相關(guān)基因Bcl-2、CuZnSOD顯著升高，表明MitoQ能夠降低細(xì)胞凋亡水平，與Dai等[18]研究結(jié)果一致；線粒體融合蛋白Mfn2介導(dǎo)線粒體內(nèi)外膜的融合，添加MitoQ能夠顯著提升Mfn2基因的相對表達(dá)量，降低線粒體分裂相關(guān)蛋白基因DNM1的表達(dá)水平，與謝南昌等[19]用線粒體分裂蛋白抑制劑來降低小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和氧化損傷水平結(jié)果相符?？傊琈itiQ可改善線粒體功能，降低細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激水平。

綜上，添加MitoQ處理凍后豬卵母細(xì)胞，能提高其線粒體功能，緩解細(xì)胞氧化損傷，降低細(xì)胞凋亡水平，從而起到促進(jìn)卵母細(xì)胞凍后體外發(fā)育水平的效果。本研究揭示了MitoQ作為新型冷凍保護(hù)劑的可能性，為卵母細(xì)胞冷凍提供了新思路。