張 穗，陳 偉，王 東，朱洪彩， 程歡歡

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201106；2 山東理工大學(xué)，淄博255000,；3貴州安順學(xué)院,安順561000)

小麥赤霉病(Gibberellazeae)是世界重要的小麥病害之一，中流行年份可造成產(chǎn)量損失5%—15%，大流行年份達(dá)10%—40%，嚴(yán)重威脅小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。在我國(guó)，小麥赤霉病分布范圍較廣泛，據(jù)估計(jì)，我國(guó)發(fā)生赤霉病的麥區(qū)面積近667萬hm2，占全國(guó)小麥總種植面積的14[1-2]。1972年以來，我國(guó)防治小麥赤霉病發(fā)生的主要手段是在小麥揚(yáng)花期噴灑化學(xué)殺菌劑多菌靈及其同類藥劑[3]。但是，長(zhǎng)期單一的化學(xué)防治，導(dǎo)致赤霉病菌對(duì)多菌靈的抗藥性日趨嚴(yán)重[4-5]。

王建新等[6]研究發(fā)現(xiàn)，江蘇、安徽、浙江、湖北、山東、河南等地小麥赤霉病菌群體中均存在抗藥性。上海地區(qū)長(zhǎng)期采用以多菌靈為主的化學(xué)防治小麥赤霉病技術(shù)，近年來防治效果呈明顯下降趨勢(shì)[7]。 本研究通過研究小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈的抗藥性，旨在為本地區(qū)建立科學(xué)合理的小麥赤霉病防治技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離培養(yǎng)和供試藥劑

供試菌株：2013—2015年分別從上海郊區(qū)浦東、金山、青浦、崇明、嘉定、寶山、奉賢和松江8個(gè)區(qū)采集小麥赤霉病穗標(biāo)本，取病粒置于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3—5 d，長(zhǎng)出玫紅色菌落后進(jìn)行鏡檢鑒定，單孢分離純化后備用。

高抗多菌靈的赤霉菌株H：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周明國(guó)教授提供。

供試藥劑：98%多菌靈原粉(上海悅聯(lián)化工有限公司生產(chǎn))。

1.2 含藥培養(yǎng)基的制作[6]

含藥培養(yǎng)基的制作：稱取99%的氯霉素0.3 g，溶解于3 000 ml PDA培養(yǎng)基中，配成含100 μgmL氯霉素的PDA，分裝至400 mL的廣口瓶中，每瓶300 ml，121 ℃滅菌30 min。根據(jù)各處理所需多菌靈母液的量，用移液槍吸取并加入經(jīng)高壓滅菌后的PDA培養(yǎng)基中，搖晃均勻，而后倒入無菌培養(yǎng)皿中即制得含藥培養(yǎng)基。

1.3 分離菌對(duì)多菌靈抗藥性水平測(cè)定[8]

1)敏感菌株和抗藥菌株的鑒定 先將所有采集的病穗標(biāo)本放入4 ℃冰箱保存7—10 d，然后進(jìn)行單孢分離。單孢分離菌分別移至含5 μgmL多菌靈的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d。凡在含5 μgmL多菌靈PDA平板上不能夠長(zhǎng)出菌落的分離菌為多菌靈敏感菌；凡能夠長(zhǎng)出菌落的分離菌為多菌靈抗性菌。

2)敏感菌株EC50的測(cè)定 在含多菌靈0(CK)、0.025 μgmL、0.05 μgmL、0.1 μgmL、0.2 μgmL、0.4 μgmL、0.8 μgmL、1.6 μgmL、2.5 μgmL的共9個(gè)濃度梯度處理的PDA平板上分別測(cè)定分離菌的菌絲生長(zhǎng)抑制活性。每處理重復(fù)3皿，25 ℃培養(yǎng)3 d，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，測(cè)量各處理的菌落直徑，并求出各分離菌對(duì)多菌靈的有效中濃度(EC50)[3，12]。

3)抗藥菌株EC50的測(cè)定 在含多菌靈0(CK)、1.25 μgmL、2.5 μgmL、5 μgmL、10 μgmL、20 μgmL、40 μgmL共7個(gè)濃度梯度的PDA平板上分別測(cè)定分離菌的菌絲生長(zhǎng)抑制活性。每處理重復(fù)3皿，25 ℃培養(yǎng)3 d，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，測(cè)量各處理的菌落直徑，并求出各分離菌對(duì)多菌靈的有效中濃度(EC50)。

根據(jù)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈抗藥性的劃分標(biāo)準(zhǔn)[5]：敏感菌株在含5 μgmL多菌靈的培養(yǎng)基上完全不能生長(zhǎng)；中抗菌株在該培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但在含50 μgmL多菌靈的培養(yǎng)基上完全不能生長(zhǎng)；高抗菌株在含50gmL多菌靈的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，但是在100μgmL的培養(yǎng)基上完全不能生長(zhǎng)；超高抗菌株在含100 μgmL多菌靈的培養(yǎng)基上仍能生長(zhǎng)?？剐员稊?shù)=抗性菌株EC50敏菌株EC50。按抗藥性倍數(shù)(RR)的高低進(jìn)行分級(jí)：敏感(RR≤5.0)、低水平抗性(5.0100.0)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2013—2015年上海郊區(qū)小麥赤霉病菌多菌靈敏感性和抗藥性種群數(shù)量及其分布情況

經(jīng)分離和鑒定，2013—2015年來自上海郊區(qū)8個(gè)區(qū)(崇明、金山、奉賢、松江、寶山、嘉定、青浦、浦東)的小麥赤霉病菌(Fusariumspp.)分離菌株共計(jì)233株，其中對(duì)多菌靈表現(xiàn)敏感的菌株207株，占總菌株數(shù)的88.84%；抗藥性菌株26株，占總菌株數(shù)的11.16%，且均屬于超高抗藥菌株(表1)。

表1 2013—2015年上海郊區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈敏感性菌株和抗藥性菌株及其分布情況

注：各區(qū)不同年份小麥赤霉病標(biāo)本的數(shù)量不同，表中數(shù)據(jù)均為各區(qū)連續(xù)3年分離菌的菌株總數(shù)。**為平均占比

從分布上看，多菌靈抗藥菌群在上海郊區(qū)的分布很不均衡。除奉賢區(qū)未分離到抗藥菌株外，金山和崇明的抗性菌株出現(xiàn)的平均頻率較低，分別為4.55%和8.22%；其次是浦東和青浦，平均頻率分別為10.91%和12.50%；松江、寶山和嘉定抗性菌株出現(xiàn)的平均頻率較高，分別為20%、27.27%和28.57%(表1)。

按照對(duì)多菌靈抗藥性病菌占群體的15%—18%，赤霉病即為大流行的標(biāo)準(zhǔn)[9],2013—2015年松江、寶山和嘉定區(qū)的小麥赤霉病均達(dá)到了大流行級(jí)別。

表2 2013—2015年上海郊區(qū)部分小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈敏感性的測(cè)定

2.2 2013—2015年上海郊區(qū)小麥赤霉病菌多菌靈抗藥種群的抗藥水平

室內(nèi)毒力測(cè)定的結(jié)果表明，上海郊區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈敏感菌株的EC50在同一年份中各區(qū)之間差異不大，但不同年份之間明顯不同(表2)。2013、2014、2015年分離菌對(duì)多菌靈敏感菌株的平均EC50值依次為(0.463 1±0.033 7) μgmL、(0.251 6±0.038 4) μgmL、(0.130 9±0.013 8) μgmL，呈逐年下降趨勢(shì)。

上海郊區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈抗藥菌株的EC50在同一年份中各區(qū)之間差異不大，但不同年份之間明顯不同(表3)。2013年和2014年抗性菌株的EC50平均值分別為(11.162 3±1.413 7) μgmL和(12.303 4±0.626 3) μgmL，兩者之間差異不大，但2015年抗性菌株的EC50平均值達(dá)到(20.530 1±1.823 0) μgmL，較前兩年抗性水平明顯升高。2013—2015年，3年敏感菌株的EC50平均值為(0.276 3±0.018 5) μgmL，平均發(fā)生頻率為90.29%；抗性菌株的EC50平均值為(17.681 5±1.477 3) μgmL；超高抗性菌株出現(xiàn)的頻率依次為5.13%、11.61%和15.38%，呈逐年上升趨勢(shì)(表3、表4)。2013、2014、2015年上海郊區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈的抗藥水平逐年上升，其抗性倍數(shù)分別為23.00、46.14和 156.84。2015年由前兩年的中等水平抗性急劇上升為高水平抗性(表4)。

表3 2013—2015年上海郊區(qū)部分小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈抗藥性的測(cè)定

表4 2013—2015年海郊區(qū)小麥赤霉病菌多菌靈抗藥種群的抗性水平

2.3 不同小麥赤霉病菌分離菌株對(duì)多菌靈抗性的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)2013來年自同一病穗的4株禾谷鐮孢分離菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定的結(jié)果表明，這些分離菌對(duì)多菌靈的EC50值與赤霉菌株H的EC50值均比較接近，在(8.586 2±2.564 6)—(14.849 1±1.665 7) μgmL，抗性比值在0.88—1.51。表明上海郊區(qū)分離的小麥赤霉病菌抗藥菌株的抗性較高且具有群體遺傳的穩(wěn)定性(表5)。

表5 2013年上海郊區(qū)同一病穗不同小麥赤霉病分離菌株對(duì)多菌靈的抗性測(cè)定

3 討論與結(jié)論

據(jù)報(bào)道，1999—2001年上海郊區(qū)小麥赤霉病菌多菌靈抗性菌群出現(xiàn)的頻率較低，為3.00%—6.03%[10]。當(dāng)抗藥菌株達(dá)到10%時(shí)，多菌靈的防治效果將下降至60%[2]。本研究結(jié)果表明， 2014和2015年該地區(qū)赤霉病菌多菌靈抗性菌株出現(xiàn)的頻率明顯增高，分別達(dá)到了11.61%和15.38%(表4)，這與近年來上海郊區(qū)小麥赤霉病發(fā)生嚴(yán)重、麥田多菌靈防治效果急劇下降的情況相吻合[2,7，12]，表明病菌多菌靈抗性菌群數(shù)量的增加和抗性水平的升高是該地區(qū)小麥赤霉病發(fā)生日趨嚴(yán)重的原因之一。

在上海各區(qū)之間多菌靈抗藥菌群的分布很不均衡。青浦、松江、寶山和嘉定區(qū)的大部分邊界與小麥赤霉病菌的多菌靈抗性水平高的江蘇毗鄰[11]，其抗藥菌群均在10%以上,這些抗藥菌群是否來自江蘇需進(jìn)一步研究(表1)。

自2013年起，上海郊區(qū)在麥田停止使用多菌靈，并大面積推廣秸稈還田耕作制度。本研究中，2013年、2014年、2015年上海郊區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈敏感的種群平均占比達(dá)到了90.29%，EC50值呈逐年下降趨勢(shì)。沒有了藥劑選擇壓力，分離菌的敏感性增強(qiáng)，這與2013年起麥田停止使用多菌靈存在明顯的關(guān)聯(lián)。多菌靈是防治小麥赤霉病的特效藥，耐雨水沖刷，且價(jià)格低廉[1]，該藥劑今后能否繼續(xù)在上海郊區(qū)使用還需進(jìn)一步監(jiān)測(cè)赤霉病菌多菌靈抗藥性菌群的占比、分布及其抗性水平等的變化情況。

盡管上海郊區(qū)小麥赤霉病菌多菌靈抗藥種群的平均占比只有11.16%，但其EC50值呈逐年上升趨勢(shì)(表1，表3，表4)，且與2013年起大面積推廣秸稈還田呈明顯的正相關(guān)性。耕作制度的改變會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生一系列的變化。秸稈全量還田，若田間處理不徹底會(huì)使田間的秸稈量增大，從而給赤霉病菌提供了充足的存活條件，也為小麥赤霉病的發(fā)生提供了必要的基礎(chǔ)條件。這些現(xiàn)象均應(yīng)引起農(nóng)業(yè)生產(chǎn)部門的高度重視，加強(qiáng)赤霉病敏感菌群和抗性菌群動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)與研究，制定科學(xué)合理防控技術(shù)體系，切實(shí)控制這一病害的發(fā)生與為害。

致謝：上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，浦東新區(qū)、金山、青浦、寶山、嘉定、松江、崇明、青浦、奉賢農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心植保部門為本研究提供了小麥赤霉病樣本材料，在此一并感謝！