梁梓敏 覃潔萍 郭海姣 羅宇東 胡華
摘 要 目的:建立同時測定芒果止咳片中沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Phenomenex Gemini C18,流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測波長為258 nm,柱溫為30 ℃,進樣量為5 μL。以沒食子酸為內參物,計算原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷的相對校正因子,并將一測多評法與外標法測定結果進行比較。結果:沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷檢測質量濃度的線性范圍分別為45.75~1 830 μg/mL(r=0.999 9)、2.525~101.0 μg/mL(r=0.999 9)、65.33~2 613 μg/mL(r=0.999 6)、9.058~362.3 μg/mL(r=0.999 9)、3.885~155.4 μg/mL(r=0.999 9)、1.870~74.8 μg/mL(r=0.999 9);定量限分別為0.571、0.643、1.053、0.854、0.830、1.500 μg/mL,檢測限分別為0.171、0.193、0.316、0.256、0.249、0.450 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗RSD均小于3%;加樣回收率分別為 98.8%~101.9%(RSD=1.3%,n=6)、94.3%~101.5%(RSD=3.3%,n=6)、97.9%~100.5%(RSD=0.9%,n=6)、98.2%~101.6%(RSD=1.2%,n=6)、102.3%~106.1%%(RSD=1.3%,n=6)、 96.6%~99.3%(RSD=1.0%,n=6)。以沒食子酸為內參物,原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷、異槲皮苷的相對校正因子分別為0.568 3、0.500 3、0.687 6、0.939 1、0.826 3;一測多評法測得原兒茶酸等5種成分的含量范圍分別為0.197~0.440、3.263~11.250、0.201~1.196、0.168~0.381、0.115~0.293 mg/片,外標法測得的含量范圍分別為0.198~0.441、3.329~11.570、0.206~1.194、0.171~0.380、0.119~0.298 mg/片,兩種方法測量結果的相對誤差為-3.80%~0.74%,且差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論:所建一測多評含量測定方法準確、可靠、重復性好,可用于同時測定芒果止咳片中6種藥效成分的含量。
關鍵詞 芒果止咳片;高效液相色譜法;一測多評法;沒食子酸;原兒茶酸;芒果苷;高芒果苷;金絲桃苷;異槲皮苷;含量測定
ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To establish a method for simultaneous determination of gallic acid, protocatechuic acid, mangiferin, homomangiferin, hyperoside and isoquercetin in Mangguo zhike tablets. METHODS: HPLC was adopted. The determination was performed on Phenomenex Gemini C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid water solution-acetonitrile (gradient elution) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 258 nm. The column temperature was set at 30 ℃, and sample size was 5 μL. Gallic acid was used as the internal substance, and the correction factors of gallic acid, protocatechuic acid, mangiferin, homomangiferin, hyperoside and isoquercetin were calculated; the results of quantitative analysis of multi-components by single marker method (QAMS) were compared with those of external standard method (ESM). RESULTS: The linear range of gallic acid, protocatechuic acid, mangiferin, homomangiferin, hyperoside and isoquercetin were 45.75-183 0 μg/mL(r=0.999 9), 2.525-101.0 μg/mL(r=0.999 9), 65.33-261 3 μg/mL(r=0.999 6), 9.058-362.3 μg/mL(r=0.999 9), 3.885-155.4 μg/mL(r=0.999 9), 1.870-74.8 μg/mL(r=0.999 9), respectively. The limits of quantification were 0.571, 0.643, 1.053, 0.854, 0.830, 1.500 μg/mL, respectively. The limits of detection were 0.171, 0.193, 0.316, 0.256, 0.249, 0.450 μg/mL, respectively. RSDs of precision, stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recoveries were 98.8%-101.9%(RSD=1.3% ,n=6), 94.3%-101.5%(RSD=3.3%,n=6), 97.9%-100.5%(RSD=0.9%,n=6), 98.2%- 101.6%(RSD=1.2%,n=6), 102.3%-106.1% (RSD=1.3%,n=6), 96.6%-99.3% (RSD=1.0%,n=6), respectively. RCFs of protocate-chuic acid, mangiferin, homomangiferin, hyperoside and isoquercetin were 0.568 3, 0.500 3, 0.687 6, 0.939 1 and 0.826 3, using gallic acid as internal substance. The content ranges of protocatechuic acid and other 4 com- ponents measured by QAMS were 0.197-0.440, 3.262-11.250, 0.201-1.196, 0.168-0.381, 0.115-0.293 mg/tablet, respectively. The content ranges measured by ESM were 0.198-0.441, 3.239-11.570, 0.206-1.194, 0.171-0.380, 0.119-0.298 mg/tablet, respectively. By comparing the content determination results by QAMS and ESM, the relative errors were -3.80%-0.74%, and there was no statistical significance (P>0.05).? CONCLUSIONS: The established QAMS method is accurate, reliable and repeatable, and can be used for content determination of 6 medicinal components in Mangguo zhike tablets.
KEYWORDS? ?Mangguo zhike tablets; HPLC; Quantitative analysis of multi-components by single marker method; Gallic acid; Protocatechuic acid; Mangiferin; Homomangiferin; Hyperoside; Isoquercetin; Content determination
芒果止咳片是由芒果葉干浸膏、魚腥草素鈉、馬來酸氯苯那敏制成的中西藥復方制劑,具有宣肺化痰、止咳平喘的功效,臨床上用于治療咳嗽、氣喘、多痰等癥[1]。現代研究表明,芒果止咳片中的主要原料藥芒果葉具有平喘、止咳、祛痰[2]、抗腫瘤[3]、護肝[4]等藥理活性。目前,芒果止咳片的質量標準參照《國家藥品標準》[5],但該標準僅有理化鑒別方法,未對其相關成分含量進行質量控制。近年來,雖然有研究對芒果止咳片中芒果苷、魚腥草素鈉、馬來酸氯苯那敏的含量進行了報道[6-8],但由于芒果葉浸膏成分復雜,其主要化學成分除芒果苷外,還有高芒果苷、金絲桃苷、異槲皮苷等黃酮類成分,沒食子酸、原兒茶酸等酚酸類成分及揮發(fā)油[9-10]。有研究發(fā)現,沒食子酸、原兒茶酸具有抗炎[11]、抑菌[12]等作用;芒果苷、高芒果苷具有祛痰、止咳[13]、抑制哮喘[14]、抗炎[15]、抑菌[16]等作用;金絲桃苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳[17]、抗氧化[18]等作用,異槲皮苷具抗炎、抑菌、抗病毒等作用[19];以上6種成分均為芒果止咳片的主要藥效成分,因此單一成分的定量檢測無法全面評價其質量。
中藥制劑發(fā)揮療效是多成分、多靶點共同作用的結果,近年來多指標成分的測定已成為中藥質量評價的發(fā)展趨勢之一[20],但多種成分含量測定會增加對照品的消耗量,加之部分對照品存在價格昂貴、制備困難、不穩(wěn)定或難以獲得的問題,從而導致檢測成本增加。一測多評法(QAMS)是針對上述問題而開發(fā)的一種測量方法[21],該方法只需要1~2個對照品就能實現對多個成分的同時檢測,近年來已廣泛應用于中藥及其制劑的質量控制[22-23]?;诖耍狙芯坎捎肣AMS法同時測定芒果止咳片中沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷等6種成分的含量;以沒食子酸為內標,計算其他5種成分的相對校正因子(f),并將QAMS法測定結果與外標法(ESM)測定結果進行比較,旨在為完善其質量標準提供參考。
1 材料
1.1 儀器
1260 型高效液相色譜(HPLC)儀,包括紫外檢測器、C0107色譜工作站(美國Agilent公司);e2695型HPLC儀,包括二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站(美國Waters公司);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);CPA225D型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司];TGL-16G型離心機(上海安亭科學儀器廠);HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。
1.2 藥品與試劑
11批芒果止咳片(廣西中醫(yī)藥大學制藥廠,批號:20161201、20161202、20170304、20170401、20170501、20170901、20180601、20180602、 20180701、20180702、20181001,規(guī)格:每片相當于原藥材2.5 g);芒果葉對照藥材(批號:121507-200501)、沒食子酸對照品(批號:110831-201605,供含量測定用)、原兒茶酸對照品(批號:110809-201205,純度:≥99.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院;高芒果苷對照品(批號:ST216701,純度:≥98%)、金絲桃苷對照品(批號:ST008801,純度:≥98%)、異槲皮苷對照品(批號:ST114401,純度:≥98%)均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司;芒果苷對照品(批號:wkq18050201,純度:≥98%)購自四川維克奇生物科技有限公司;乙腈為色譜純,甲醇為分析純,水為超純水。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱:Phenomenex Gemini C18(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~10 min,5%B→7%B;10~20 min,7%B→11%B;20~25 min,11%B→13%B;25~40 min,13%B→16%B;40~50 min,16%B→20%B;50~60 min,20%B→25%B;60~70 min,25%B→35%B;70~75 min,35%B);流速:1.0 mL/min;檢測波長:258 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷對照品適量,精密稱定,加70%甲醇溶解,制成上述6種成分質量濃度分別為1.830 0、0.101 0、2.613 0、0.362 3、0.155 4、0.074 8 mg/mL的混合對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備 取芒果止咳片20片,去糖衣,研細,取粉末0.3 g,精密稱定,加70%甲醇25 mL,超聲(功率:200 W,頻率:40 kHz,下同)處理40 min,濾過,殘渣加70%甲醇25 mL,超聲處理40 min,濾過,合并濾液,水浴揮干,殘渣加70%甲醇復溶并定容至10 mL量瓶中,搖勻,以13 000 r/min離心10 min,取上清液,即得供試品溶液。
2.2.3 陰性溶液的制備 按處方工藝制備缺芒果葉的陰性樣品,按“2.2.2”項下方法制備陰性溶液。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗
分別取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液(批號:20180601)和陰性溶液適量,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。結果,混合對照品溶液與供試品溶液在相同保留時間處均有相應的色譜峰出現,各色譜峰分離較好;陰性溶液在相應保留時間處沒有色譜峰出現,且對測定無干擾;理論板數以金絲桃苷峰計不低于120 000,詳見圖1。
2.4 線性關系考察
取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.125、0.5、1.0、2.0、4.0 mL,分別置于5 mL量瓶中,加70%甲醇稀釋至刻度,得到5個不同質量濃度的混合對照品溶液,另取 “2.2.1”項下混合對照品溶液(共6種不同質量濃度的溶液),按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以各待測成分質量濃度(x,μg/mL)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸,結果見表1。
2.5 定量限與檢測限考察
取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,加70%甲醇逐級稀釋,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結果,沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷的定量限分別為0.571、0.643、1.053、0.854、0.830、1.500 μg/mL,檢測限分別為0.171、0.193、0.316、0.256、0.249、0.450 μg/mL。
2.6 精密度試驗
取“2.2.1”項下混合對照品溶液1.25 mL,置于5 mL量瓶中,加70%甲醇稀釋并定容,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄峰面積。結果,沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.17%、0.18%、0.19%、0.22%、0.17%、0.27%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗
取“2.2.2”項下供試品溶液(批號:20180601)適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結果,沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.29%、0.76%、0.32%、0.48%、0.70%、2.00%(n=6),表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。
2.8 重復性試驗
精密稱取芒果止咳片(批號:20180601)粉末,共6份,每份0.3 g,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并按標ESM法計算樣品含量。結果,沒食子酸、原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷的平均含量分別為4.823、0.226 9、10.89、1.198、0.381 3、0.183 6 mg/片,RSD分別為0.39%、0.33%、0.59%、0.50%、1.70%、2.30%(n=6),表明本方法重復性良好。
2.9 加樣回收率試驗
取已知含量的芒果止咳片粉末(批號:20180601)0.15 g,共6 份,分別精密加入含沒食子酸 0.953 6 mg/mL、原兒茶酸0.049 0 mg/mL、芒果苷2.187 mg/mL、高芒果苷0.130 0 mg/mL、金絲桃苷 0.070 0 mg/mL、異槲皮苷0.050 0 mg/mL的混合對照品溶液3 mL,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結果見表2。
2.10 相對校正因子的測定
2.10.1 不同質量濃度混合對照品溶液的相對校正因子 取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL,分別置于5 mL量瓶中,加70%甲醇稀釋至刻度,得5個不同質量濃度的混合對照品溶液,另取 “2.2.1”項下混合對照品溶液(共6種不同質量濃度的溶液),按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。重復測定3次。以沒食子酸峰為內參峰(S),分別計算原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷相對于沒食子酸的相對校正因子(fk/s),fk/s=(As×Ci)/(Cs×Ai),式中As為內參物對照品峰面積,Cs為內參物對照品質量濃度,Ai為待測成分峰面積,Ci為待測成分質量濃度。計算結果見表3。結果,不同質量濃度混合對照品溶液中各成分相對校正因子的RSD均小于2.5%,提示在不同質量濃度范圍內各成分質量濃度變化對其相對校正因子基本無影響。
2.10.2 不同色譜柱的相對校正因子 分別考察不同色譜柱[Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Waters SunFireR C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Shimadzu Shim-pack CLC-ODS C18(6.0 mm×15 cm,5 μm),下同]對各成分相對校正因子的影響。重復測定3次。以沒食子酸峰為內參峰(S),分別計算原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷相對于沒食子酸的相對校正因子(fk/s),結果見表4。結果表明,不同色譜柱下各成分相對校正因子的RSD均小于1.5%,符合QAMS法的相關規(guī)定[21]。
2.10.3 不同儀器的相對校正因子 分別考察不同色譜柱在不同儀器(Agilent 1260型和Waters e2695型HPLC儀)上對各成分相對校正因子的影響。重復測定3次。以沒食子酸峰為內參峰(S),分別計算原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷相對于沒食子酸的相對校正因子(fk/s),結果見表5。結果提示,不同儀器下各成分相對校正因子的RSD均小于3.0%,符合QAMS法的相關規(guī)定[21]。
2.10.4 不同柱溫和不同流速的相對校正因子 分別考察不同柱溫(25、30、35 ℃)及不同流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)對各成分相對校正因子的影響,以沒食子酸峰為內參峰(S),分別計算原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷相對于沒食子酸的相對校對因子(fk/s),結果見表6。結果,不同柱溫和不同流速下各成分相對校正因子的RSD均小于1.5%,符合QAMS法的相關規(guī)定[21]。
2.10.5 色譜峰的定位 QAMS法用于同時定量多指標成分時需要對各待測成分色譜峰進行定位[21]。目前,QAMS法用于色譜峰定位的方法主要有相對保留時間定位法和保留時間差值定位法[23]。本研究在Agilent 1260型和Waters e2695型HPLC儀上分別采用3 種不同色譜柱考察了各待測成分色譜峰的相對保留時間(t)和保留時間差值(Δt)的重現性。結果顯示,在相同色譜條件下,除原兒茶酸的RSD大于5%外,芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷相對保留時間的RSD≤3.7%;而保留時間差值的RSD≤3.0%。因此,采用QAMS法進行含量測定時,除原兒茶酸需用定性對照品進行色譜峰定位外,其余成分可采用保留時間差值法定位,結果見表7、表8。
2.11 QAMS法與ESM法含量測定結果比較
取11批芒果止咳片樣品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,采用QAMS法(按“2.10.5”項下方法對各目標成分進行色譜峰定位,記錄峰面積,再按“2.10.1”項下建立的校正因子計算各成分的含量)測定樣品中各成分的含量,并將測定結果與ESM法進行比較,平行測定3 次。兩種方法含量測定結果的差異采用相對誤差(RE)進行評價,結果見表9。結果,兩種方法原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金補桃苷、異桷檞皮苷含量測定結果的RE為-3.80%~0.74%。經SPSS 22.0軟件進行t檢驗,結果顯示兩種方法上述成分的測定結果比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示QAMS法以沒食子酸為內參物同時測定芒果止咳片中其余5種成分的準確性良好。
3 討論
本研究通過對水、甲醇、乙醇、40%甲醇、70%甲醇、40%乙醇、70%乙醇為提取溶劑進行考察。結果顯示,以70%甲醇為提取溶劑時各待測成分提取效率最好,故選擇70%甲醇為提取溶劑。此外,筆者還考察了冷浸、超聲、回流3種提取方式的提取效果。結果發(fā)現,超聲和回流提取的提取率均較高,且差異不大,考慮到操作簡便性,故選擇超聲提取。同時,本研究對不同提取時間(20、30、40、50、60 min)的提取效果進行考察。結果發(fā)現,提取40 min時,各待測成分提取率不再增加,故選擇提取時間為40 min;對不同提取溶劑體積(25、50、75 mL)和提取次數(1、2、3次)進行考察。結果發(fā)現,25 mL提取2次和25 mL提取3 次時含量較高,且差異不大,提示以70%甲醇25 mL提取2 次可基本提取完全。與此同時,本研究通過二極管陣列檢測器對各待測成分在190~400 nm全波長范圍內進行掃描。結果顯示,在258 nm波長處各待測成分均有較好吸收,且芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷和異槲皮苷在258 nm波長處有最大吸收,故選擇258 nm為檢測波長。
沒食子酸為芒果葉中含量較高的酚酸類成分[24],其在芒果止咳片中含量較高,且穩(wěn)定性好,同時沒食子酸對照品價格便宜、易得,因此本研究以沒食子酸為內參物,測定了其他5種成分的相對校正因子,同時考察了不同對照品質量濃度、流速、柱溫、儀器、色譜柱對相對校正因子的影響。結果顯示,相對校正因子的RSD 均小于3%,提示所建QAMS法的相對校正因子耐用性良好,符合相關規(guī)定(RSD<5%)[21]。
本研究結果顯示,以沒食子酸峰為內參峰進行各待測成分色譜峰定位時,除原兒茶酸相對保留時間的RSD大于5%外,其他4種成分無論采用相對保留時間法還是保留時間差值法進行定位的RSD均小于4%,但采用保留時間差定位的RSD值相對較小,故除原兒茶酸外的其余成分本研究采用保留時間差法定位。原兒茶酸雖無法采用相對保留時間法定位,但其對照品便宜、易得,故采用QAMS法進行含量測定時,原兒茶酸色譜峰可用定性對照品進行定位[21,24]。
含量測定結果顯示,QAMS法與ESM法原兒茶酸、芒果苷、高芒果苷、金絲桃苷、異檞皮苷含量的測定結果無顯著性差異,表明本方法準確、可行,結果可靠,這為芒果止咳片的質量控制提供了新的思路;但不同批次芒果止咳片中各成分含量存在差異,其中以芒果苷和高芒果苷的含量差異尤為明顯,其中4批(20161201、20161202、20170304、20170401)的芒果苷和高芒果苷含量較低,其原因可能為存放時間較久造成含量下降,或與芒果葉藥材來源于不同產地或采收季節(jié)不同有關[26]。
綜上所述,所建QAMS含量測定方法準確、可靠,重復性好,可用于同時測定芒果止咳片中6種成分的含量。
參考文獻
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(收稿日期:2019-09-22 修回日期:2020-02-13)
(編輯:陳 宏)