付敏 李明華 耿嵐

【摘要】 目的：探究白藜蘆醇對大鼠凍存卵巢組織自體異位移植功能的影響。方法：選取24只成熟雌性Wister大鼠，并分為空白對照組、移植組、低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組，每組各6只。移植組、低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組采用手術(shù)摘取卵巢，使用玻璃化冷凍保存2周。低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組卵巢組織在白藜蘆醇溶液中平衡，且在大鼠凍存卵巢組織自體異位移植前、后分別腹腔注射5、10 μmol/L白藜蘆醇處理，移植組注射等量生理鹽水。使用HE染色后光鏡下觀察卵泡情況，并記錄各組大鼠異常卵泡數(shù)目百分比。記錄各組大鼠月經(jīng)恢復(fù)情況，檢測各組大鼠血清內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧基團（ROS）含量水平。分別于第4、8周檢測各組大鼠血清激素E2及P的分泌情況。結(jié)果：相比空白對照組，移植組異常卵泡數(shù)目百分比、ROS含量水平均顯著升高，SOD含量及第4、8周大鼠E2及P含量均顯著降低（P<0.05）;相比移植組，低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組異常卵泡數(shù)目百分比、月經(jīng)恢復(fù)時間、ROS含量水平均顯著降低，第4、8周E2、P和SOD含量均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：白藜蘆醇對大鼠凍存卵巢組織自體異位移植功能恢復(fù)有促進作用，同時可以降低大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)保護大鼠卵巢。

【關(guān)鍵詞】 卵巢組織 自體異位移植 白藜蘆醇 冷凍保存

Effects of Resveratrol on Autologous Ectopic Transplantation of Frozen Ovarian Tissues in Rats/FU Min， LI Minghua， GENG Lan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（01）： 00-005

[Abstract] Objective： To investigate the effects of Resveratrol on autologous ectopic transplantation of frozen ovarian tissues in rats. Method： A total of 24 mature female Wister rats were enrolled and divided into blank control group， transplantation group， low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group， 6 cases in each group. The transplantation group， low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group were given surgery to obtain ovaries. And they were preserved by vitrification for 2 weeks. Before and after autologous ectopic transplantation of frozen ovarian tissues in rats， low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group were intraperitoneally injected with 5 and 10 μmol/L Resveratrol. The transplantation group was injected with same amount of Normal Saline. After HE staining， follicles were observed under light microscope. The percentage of abnormal follicles number in each group was recorded， the recovery of menstruation in each group was recorded， the levels of oxidative stress related substances such as superoxide dismutase （SOD） and reactive oxygen species （ROS） in serum of each group were detected. On the 4th week and 8th week， secretion of serum hormones E2 and P in each group were detected. Result： Compared with the blank control group， percentage of abnormal follicles number and ROS level were significantly increased in transplantation group. The levels of SOD E2 and P on 4th week and 8th week were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the transplantation group， percentage of abnormal follicles number， recovery time of menstruation and ROS level were significantly decreased in low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group， the levels of E2 and P on 4th week and 8th week and SOD level were significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Resveratrol can promote function recovery of autologous ectopic transplantation of frozen ovarian tissue in rats， and reduce oxidative stress response to protect rat ovaries.

[Key words] Ovarian tissue Autologous ectopic transplantation Resveratrol Cryopreservation

First-authors address： Peking University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.01.001

卵巢冷凍移植是女性生育力保存的重要部分，是解決面臨放化療的年輕女性患者生育問題的重要手段[1-2]。隨著近20年腫瘤治療學(xué)的發(fā)展，近5年女性腫瘤死亡率以每年1.6%的速度下降，越來越多存活至生育期的女性有生育需求，卵巢冷凍移植成為當(dāng)下關(guān)注的研究項目之一。目前女性生育力保存包括胚胎、卵母細(xì)胞及卵巢的冷凍保存[3]。胚胎冷凍保存已經(jīng)成熟，卵母細(xì)胞的冷凍保存也已經(jīng)走出了試驗階段[4-5]。但是，對于不能推遲腫瘤治療時間和不允許接受促排卵治療的女性沒有辦法采用冷凍胚胎與成熟卵母細(xì)胞的方式進行生育力保存，同時我國政策不允許未婚女性冷凍胚胎及卵母細(xì)胞，使得卵巢冷凍移植亟待解決。本文研究白藜蘆醇對大鼠凍存卵巢組織自體異位移植功能的影響，以期了解白藜蘆醇對大鼠凍存卵巢組織自體異位移植功能的影響，為卵巢冷凍提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗研究時間為2017年12月

-2018年8月，成熟雌性Wiste大鼠，8～10周齡，體重200～220 g，購自廣昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物實驗室資質(zhì)情況：許可證號：SYXK（粵）2010-0106，所有大鼠分6個籠子飼養(yǎng)，每個籠子4只。所有大鼠均在本院動物中心實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，該實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 分組與干預(yù) 每只大鼠2個卵巢，每個卵巢切成2片，對卵巢組織薄片進行處理和觀察，本實驗共納入大鼠24只，隨機分為4組，每組大鼠6只，每組24片卵巢組織薄片。不同濃度白藜蘆醇（Sigma公司，批號：R5010）采用生理鹽水配制而成。對照組不經(jīng)過任何處理的卵巢組織，進行新鮮移植;低劑量白藜蘆醇組分別于卵巢組織切除凍存前1 h、移植后腹腔注射5 μmol/L白藜蘆醇5 mL，卵巢組織解凍后在0.5 μmol/L白藜蘆醇中孵育10 min;高劑量白藜蘆醇組分別于卵巢組織切除凍存前1 h、移植后靜脈注射10 μmol/L白藜蘆醇5 mL，卵巢組織解凍后在1 μmol/L白藜蘆醇中孵育10 min;移植組常規(guī)對卵巢組織進行冷凍、復(fù)蘇和移植，不經(jīng)過白藜蘆醇處理。

1.2.2 卵巢組織獲取 將24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，以手術(shù)方式獲取卵巢，手術(shù)前30 min用肌注鹽酸氯胺酮（生產(chǎn)廠家：浙江九旭藥業(yè)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20023609，規(guī)格：5 mg/kg）進行全身麻醉，手術(shù)切開采用臍下正中切口行腹部手術(shù)獲取卵巢組織。

1.2.3 卵巢組織的冷凍保存與復(fù)蘇 基礎(chǔ)工作液：PBS+10%人血清白蛋白（HAS，SAGE，美國）;冷凍平衡液：PBS+10% HSA+7.5%（v/v）二甲亞砜（DMSO，Sigma，美國）+7.5%（v/v）乙二醇（EG，F(xiàn)luka，美國）;冷凍液：PBS+10% HSA+15%（v/v） DMSO+20%（v/v） EG+0.5M蔗糖（Sucrose，Sigma，

美國）。卵巢冷凍前用注射器針頭刺破肉眼可見的大卵泡，將卵巢組織切成4 mm×2 mm×1 mm的薄片。玻璃化冷凍：將卵巢組織薄片放在冷凍平衡液平衡25 min，放入冷凍液平衡15 min，將冷凍片平鋪在載體上，植入外套管中并旋緊，置入液氮罐。解凍液的組成：（1）PBS+10%HSA+1M Sucrose;（2）PBS+10%HSA+0.5M Sucrose，（3）PBS+

10%HSA+0.25M Sucrose;（4）PBS+10%HAS。解凍前將（1）復(fù)溫至37 ℃，其余步驟在室溫進行。復(fù)蘇：將樣本自液氮取出后置于（1）中1 min，然后置于（2）～（4）中各3 min。低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組的卵巢組織在復(fù)蘇后分別于100、

200 μmol/L基礎(chǔ)工作液中平衡10 min后待用。

1.2.4 卵巢組織移植 實驗大鼠麻醉后仰臥位固定，行腹部正中切口，將已復(fù)蘇的卵巢組織移植于腹膜，逐層縫合。

1.2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)含量檢測 從大鼠頸總動脈插管接取0.1 mL血液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測SOD、ROS的含量。

1.2.6 組織切片制備、染色與觀察 8周后處死大鼠，取大鼠卵巢使用10%福爾馬林固定大鼠，使用二甲苯、酒精逐級脫水和石蠟包埋后進行連續(xù)5 μm切片，常規(guī)HE染色。每隔8張取一張切片在光學(xué)顯微鏡下單盲法觀察原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡的形態(tài)，對每個卵巢組織片中形態(tài)正常和形態(tài)異常的各級卵泡分別計數(shù)，計算出每個卵巢組織片中形態(tài)正常的各級卵泡的百分率和形態(tài)異常的各級卵泡的百分率。為了避免卵泡的重復(fù)計數(shù)，各級卵泡的計數(shù)以卵母細(xì)胞核作為標(biāo)記。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，作圖軟件采用Graph Pda Prism 5，計量資料用（x±s）表示，分析使用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HE染色情況與大鼠異常卵泡百分比比

較 由圖1可以看出，空白對照組大鼠卵巢卵泡形態(tài)正常，排列較為均勻;移植組大鼠卵泡形態(tài)出現(xiàn)核變形、顆粒細(xì)胞與基底膜剝離，卵泡內(nèi)有空泡形成;低劑量白藜蘆醇組仍有少數(shù)細(xì)胞凸向卵泡腔，間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，失去致密性，高劑量白藜蘆醇組卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，卵泡排列較為整齊?？瞻讓φ战M異常卵泡數(shù)目百分比為（5.36±0.32）%，移植組為（28.32±2.84）%，低劑量白藜蘆醇組為（19.18±2.65）%，高劑量白藜蘆醇組為（11.87±2.01）%。相比空白對照組大鼠，移植組大鼠異常卵泡數(shù)目百分比顯著升高（t=13.863，P=0.000）。相比移植組，低劑量白藜蘆醇組大鼠異常卵泡數(shù)目百分比顯著降低（t=3.759，P=0.001）;相比移植組，高劑量白藜蘆醇組大鼠異常卵泡數(shù)目百分比顯著降低（t=8.153，P=0.000）。

2.2 各組大鼠月經(jīng)恢復(fù)時間 移植組大鼠月經(jīng)恢復(fù)時間為（20.51±2.50）d，顯著長于低劑量白藜蘆醇組的（15.50±2.51）d（P<0.05）;相比低劑量白藜蘆醇組，高劑量白藜蘆醇組的（11.51±1.50）d顯著降低（P<0.05）。

2.3 各組大鼠雌激素分泌情況 相比空白對照組大鼠，移植組大鼠術(shù)后4周及術(shù)后8周E2及P含量水平顯著降低（P<0.05）;相比移植組，低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組大鼠術(shù)后4周及術(shù)后8周E2及P含量水平顯著升高（P<0.05）。見表1。

2.4 各組大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激反應(yīng)情況 相比空白對照組大鼠，移植組大鼠ROS含量水平顯著升高（P<0.05），SOD含量水平顯著降低（P<0.05）;相比移植組，低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組大鼠ROS含量水平顯著降低（P<0.05），SOD含量水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

3 討論

白藜蘆醇化學(xué)名稱為（E）-3，5，4-三羥基二苯乙烯，屬于于非黃酮類的多酚化合物，其分子式為C14H12O3，相對分子質(zhì)量為228.25[6]。白藜蘆醇最初在葡萄中被發(fā)現(xiàn)，隨著技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)在可以從葡萄、花生等提取到白藜蘆醇，其中新鮮的葡萄皮中含量最高，達50～100 mg/g，但白藜蘆醇提取方法較復(fù)雜，主要以人工合成為主[7-8]。陳夢微等[9]研究表明，白藜蘆醇具有清除自由基的能力，是一種較好的抗氧化劑。同時何淼等[10]研究表明：白藜蘆醇對缺血再灌注損傷也有一定的緩解作用，可以應(yīng)用于器官移植時移植器官缺血的保護。

本研究發(fā)現(xiàn)，實驗大鼠均恢復(fù)月經(jīng)周期，說明將大鼠卵巢組織移植于腿根部肌肉內(nèi)較為成功，這可能是因為大鼠大腿根部具有豐富的血管，血液供應(yīng)良好，組織疏松，且可以避免移植卵巢受到擠壓。研究中發(fā)現(xiàn)使用白藜蘆醇處理后的大鼠月經(jīng)恢復(fù)時間短于移植組，這可能是因為白藜蘆醇緩解了大鼠卵巢在移植過程中受到的暫時性缺血損傷，有效地保護了大鼠的卵巢，使得其移植后功能恢復(fù)較快。E2和P是卵巢分泌的兩種重要激素，它們與垂體分泌的促性腺激素共同維持雌性個體的月經(jīng)周期，同時可以通過檢測血清E2和P的含量水平反應(yīng)大鼠卵巢功能情況[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，相比移植組，低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組大鼠術(shù)后第4、8周血清E2、P含量均顯著升高（P<0.05）。說明大鼠卵巢分泌的E2和P顯著增加，這可能是因為使用白藜蘆醇處理后，白藜蘆醇降低了大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得大鼠卵巢移植后較為成功，且卵巢功能得到了顯著的恢復(fù)。王曉光等[12]研究表明：白藜蘆醇可以降低了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得卵巢移植后，血清E2及P含量均升高，說明卵巢功能得到了恢復(fù)，與本研究得出的結(jié)論相一致。

隨著生活、醫(yī)療的需要，活性氧族的研究越來越成熟，實驗證實了ROS的大量堆積是導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的重要機制之一[13-14]。高婷等[15]研究表明：在健康的細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但是在氧化應(yīng)激情況下，會產(chǎn)生大量的ROS并破壞線粒體膜和細(xì)胞膜的完整性，使上皮細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶SOD、GPX等酶的大量釋放。因此，ROS損傷被認(rèn)為是引起細(xì)胞氧化損傷的主要機制。抗氧化體系主要包括酶系和非酶系兩大類，酶體系中，最主要的是SOD，其含量多少可以直接反應(yīng)氧化應(yīng)激的程度[16-18]。本研究在中發(fā)現(xiàn)相比移植組，低劑量白藜蘆醇組和高劑量白藜蘆醇組大鼠ROS含量水平顯著降低，SOD含量水平顯著升（P<0.05）。說明使用白藜蘆醇后降低了大鼠體內(nèi)的活性氧族物質(zhì)，保護了線粒體膜和細(xì)胞膜的完整性，使得細(xì)胞內(nèi)酶SOD不被釋放到血清中，降低了氧化損傷。莊少虹等[19]研究表明：白藜蘆醇可以有效降低體內(nèi)氧化反應(yīng)保護細(xì)胞膜和線粒體膜的完整性，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，白藜蘆醇對大鼠凍存卵巢組織自體異位移植功能恢復(fù)有促進作用，同時可以保護大鼠卵巢，其作用機制可能與降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。白藜蘆醇降低了大鼠體內(nèi)的氧自由基含量，減緩了氧化反應(yīng)對大鼠卵巢的損傷，同時促進大鼠卵巢在移植后的恢復(fù)。但大鼠卵巢冷凍和人類卵巢冷凍存在一定的區(qū)別，在后續(xù)的實驗中將進行臨床卵巢冷凍移植研究并探討線粒體功能狀態(tài)，進一步研究白藜蘆醇在人類卵巢凍存和移植中的作用機制。

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（收稿日期：2019-06-19） （本文編輯：程旭然）