董嘉媚，劉亞雄，樊洪利，羅卓雅*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 廣州 510006；2.廣東省藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局 藥品快速檢驗技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510663)

健康產(chǎn)品包括藥品、食品、保健食品、化妝品，是人們最基礎(chǔ)的日常生活用品[1]。沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)是一種常用平喘藥，屬于β2受體激動劑[2]。研究表明，長期服用沙丁胺醇會對人的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生危害[3-4]。一些不法商家為了謀取利益，向聲稱具有止咳平喘效果的中成藥以及保健品等健康產(chǎn)品中非法添加沙丁胺醇，嚴重損害消費者利益。

目前沙丁胺醇的常見檢測方法包括色譜法和光譜法[5-8]，如原國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的食藥監(jiān)食監(jiān)三[2016]28號文[9]《食品藥品監(jiān)管總局關(guān)于印發(fā)保健食品中非法添加沙丁胺醇檢驗方法等8項檢驗方法的通知》就采用了高效液相色譜法。但這些方法大多依賴貴重儀器、操作繁瑣、需要專業(yè)人員且無法進行現(xiàn)場檢驗。沙丁胺醇的現(xiàn)場檢測手段包括免疫法[10-13]和電化學(xué)法[14-17]，但免疫檢測中的抗體存在制備困難、價格昂貴、批間差異大等缺點[18-19]；而電化學(xué)法也沒有真正實現(xiàn)不借助儀器的現(xiàn)場快速檢測。

核酸適配體(簡稱適配體，Aptamer)是一種短的單鏈核苷酸(DNA或RNA)，對目標物具有高親和力和特異性[20-21]。近年來，適配體以其體外合成、易于修飾以及穩(wěn)定性高等優(yōu)點[21-25]受到越來越多的關(guān)注。

本實驗使用二氧化硅微球固定ssDNA結(jié)合蛋白(ssDNA binding protein，SSB)和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)，并利用二氧化硅微球的大比表面積實現(xiàn)信號放大。其檢測機理為，沙丁胺醇與SSB競爭與適配體結(jié)合，由于沙丁胺醇與適配體的親和性更高，使得SSB與適配體組成的“開關(guān)”被沙丁胺醇打開，磁分離后，游離的二氧化硅微球@SSB@HRP復(fù)合物與其作用底物發(fā)生顯色反應(yīng)產(chǎn)生肉眼可見的結(jié)果。該傳感器制備方法簡單、靈敏快速、抗干擾性強，檢測過程僅需45 min，無需任何儀器，實現(xiàn)了真實樣品中非法添加沙丁胺醇的現(xiàn)場快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

磁力攪拌器(德國IKA公司)；Nano-60超微量紫外可見分光光度計(德國Implen公司)；離心機(美國Beckman Coulter公司)。

羧基化磁性微球(Magnetic beads，MB，直徑3 μm，10 mg/mL)購自上海英芮誠生化科技有限公司；羧基化二氧化硅微球(SiO2，直徑50 nm，50 mg/mL)購自北京中科雷鳴科技有限公司；ssDNA結(jié)合蛋白購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；乙醇胺和嗎啉乙磺酸(MES)購自上海麥克林生化科技有限公司；沙丁胺醇標準品購于上海源葉生物科技有限公司；辣根過氧化物酶、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和沙丁胺醇核酸適配體均購于上海生工生物科技股份有限公司；氨基修飾的沙丁胺醇適配體序列：5’-NH2-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTTGTAAAACTTAATCAGCGATTCTCTATGTCTGCAATTACCCTATGC GTGCTACCGTGAA-3’[26]；實驗用水為去離子水。

1.2 緩沖液配制

偶聯(lián)緩沖液(0.02 mol/L MES，pH 5.0)；適配體結(jié)合緩沖液(BB，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，pH 7.4)；TMB緩沖液(0.1 mol/L Na3C6H5O7，0.2 mol/L Na2HPO4，pH 5.2)；顯色液(30% H2O2、1 mg/mL TMB乙醇溶液與TMB緩沖液以體積比1∶100∶900混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.3 實驗方法

1.3.1 磁性探針(MB-aptamer)的制備取0.1 mg MB分散于400 μL偶聯(lián)緩沖液中，向其中加入偶聯(lián)劑EDC-NHS(4∶1)至其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，室溫活化30 min，以偶聯(lián)緩沖液洗滌3次，除去多余偶聯(lián)劑；取5 μL 濃度為100 μmol/L的沙丁胺醇適配體，95 ℃水浴5 min，立即置入冰浴中延展10 min，隨后加入到活化的MB中，室溫下振蕩孵育1 h，得到磁性探針MB-aptamer；磁性分離，以偶聯(lián)緩沖液洗滌3次，用400 μL含有1%乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液將MB-aptamer重新分散，室溫下振蕩孵育1 h封閉MB上殘余羧基；磁性分離，BB洗滌3次，得到的磁性探針MB-aptamer懸于200 μL BB中備用。

1.3.2 二氧化硅微球-蛋白復(fù)合物(SiO2@SSB@HRP)的制備取5 mg羧基二氧化硅微球分散于900 μL偶聯(lián)緩沖液中，加入偶聯(lián)劑EDC-NHS(4∶1)至其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，室溫下活化30 min；5 000 r/min離心5 min，沉淀洗滌3次后重懸于400 μL偶聯(lián)緩沖液中；加入10 μL 10 μg/μL HRP和5 μL 2 μg/μL SSB，室溫振蕩孵育1 h；加入400 μL含有2%乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液，室溫下振蕩孵育1 h封閉二氧化硅微球上殘余羧基；5 000 r/min離心5 min，去離子水洗滌3次，所得復(fù)合物標記為SiO2@SSB@HRP，懸于200 μL BB中備用。

1.3.3 磁性探針與二氧化硅微球-蛋白復(fù)合物的連接(MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP)將上述得到的MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP混合，37 ℃振蕩孵育2 h；磁性分離吸棄上清液，BB洗滌3次，復(fù)懸后再于室溫振蕩孵育1 h，磁性分離吸棄上清液，BB洗滌3次，將結(jié)合不牢固的SiO2@SSB@HRP去除；最終得到的產(chǎn)物標記為MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP，分散于300 μL BB中作為檢測液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 沙丁胺醇的檢測取“1.3.3”制備的檢測液6份，每份50 μL，分別加入沙丁胺醇對照品和BB，使其最終體積均為100 μL，沙丁胺醇濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L，室溫下捕獲反應(yīng)30 min；將6份待測液分別磁性分離，小心吸取上清液70 μL于新的1.5 mL EP管中；加入100 μL TMB-H2O2顯色液，觀察顏色變化，判定結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

如圖1所示，氨基修飾的沙丁胺醇適配體與羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)構(gòu)成磁性探針MB-aptamer，二氧化硅微球負載HRP與SSB得到SiO2@SSB@HRP復(fù)合物，通過SSB與單鏈DNA(適配體本質(zhì)是單鏈DNA)的結(jié)合作用將磁性探針MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP連接形成檢測復(fù)合物MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP。當(dāng)待測液中存在適配體的靶標，即目標物沙丁胺醇時，由于SSB與適配體的親和作用(Kd=1.1 μmol/L)[27]小于適配體與沙丁胺醇的親和作用(Kd=53.60 nmol/L)[26]，因此沙丁胺醇將與適配體特異性結(jié)合，同時適配體與SSB的結(jié)合作用被破壞，即沙丁胺醇作為“鑰匙”，將適配體與SSB組成的“開關(guān)”打開。最終，檢測復(fù)合物MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP產(chǎn)生MB-aptamer～SAL與SiO2@SSB@HRP兩部分產(chǎn)物，經(jīng)過磁性分離，MB-aptamer～SAL位于EP管底部，而上清液中的SiO2@SSB@HRP復(fù)合物被吸取并與HRP的底物TMB進行反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的藍色現(xiàn)象，從而可進行結(jié)果判定。

圖1 基于適配體傳感器檢測沙丁胺醇原理Fig.1 Detection of SAL by the developed aptamer sensor

圖2 SiO2@SSB@HRP復(fù)合物表征圖Fig.2 UV-Vis spectra of HRP(a),SSB(b) and SiO2@SSB@HRP(c)

2.2 SiO2@SSB@HRP表征

應(yīng)用紫外-可見分光光度法對SiO2@SSB@HRP復(fù)合物進行表征。如圖2所示，SSB和HRP分別在270 nm和403 nm處有吸收峰(曲線a，b)，而SiO2@SSB@HRP復(fù)合物在波長270 nm和403 nm附近出現(xiàn)吸收峰(曲線c)，證明SSB、HRP負載成功，即SiO2@SSB@HRP復(fù)合物制備成功。

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 磁性微球與沙丁胺醇適配體比例優(yōu)化取0.1 mg磁性微球，分別與不同體積(1、2、5、8、10 μL)的適配體(濃度為100 μmol/L)進行實驗，發(fā)現(xiàn)體系吸光度隨著適配體體積的增加先升高后降低，當(dāng)適配體體積為5 μL時獲得最大吸光度。因此選用0.1 mg磁性微球與5 μL適配體(100 μmol/L)制備MB-aptamer。

2.3.2 SSB與HRP比例優(yōu)化取5 mg二氧化硅微球，分別與SSB和HRP不同質(zhì)量比的混合物(10∶1、1∶1、1∶10、1∶25、1∶50)進行實驗。結(jié)果表明SSB和HRP比例為1∶10時可獲得最大吸光度，因此選用SSB和HRP的質(zhì)量比為1∶10。

2.3.3 二氧化硅微球與SSB及HRP的結(jié)合比例優(yōu)化取5 mg二氧化硅微球，分別與不同質(zhì)量的SSB與HRP混合物(2、5、10、20、25 μg SSB分別對應(yīng)與20、50、100、200、250 μg HRP混合)進行實驗。結(jié)果表明HRP取100 μg、SSB取10 μg時可獲得最大吸光度。因此選用5 mg二氧化硅微球與100 μg HRP、10 μg SSB制備SiO2@SSB@HRP。

2.3.4 MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP結(jié)合比例優(yōu)化取“2.3.1”優(yōu)化方案制備得到的200 μL MB-aptamer分別與“2.3.3”優(yōu)化方案制備得到的不同體積(50、100、200、300、400 μL)的SiO2@SSB@HRP進行實驗。結(jié)果顯示，吸光度隨著SiO2@SSB@HRP體積的增加先增加后趨于平緩，當(dāng)SiO2@SSB@HRP的體積為200 μL時獲得最大吸光度，因此選用200 μL MB-aptamer與200 μL SiO2@SSB@HRP進行實驗。

2.3.5 顯色反應(yīng)時間優(yōu)化為確定結(jié)果判定的最佳時間，對一系列反應(yīng)時間的吸光度進行測定。發(fā)現(xiàn)當(dāng)顯色反應(yīng)時間為15 min時，吸光度達到最大值，因此選擇15 min作為顯色反應(yīng)時間。

2.4 沙丁胺醇加標實驗

對一系列濃度梯度沙丁胺醇進行檢測，顯色反應(yīng)產(chǎn)物用超微量紫外-可見分光光度計定量檢測。結(jié)果顯示，顯色反應(yīng)產(chǎn)物的顏色隨沙丁胺醇濃度增加逐漸加深，當(dāng)濃度達到10 μmol/L時，顯色反應(yīng)產(chǎn)物的顏色由藍色變?yōu)榫G色。沙丁胺醇濃度在0.1～10 μmol/L(23.9～2.39×103μg/L)范圍內(nèi)與體系吸光度呈良好的線性關(guān)系(r2=0.995 9)。通過一系列濃度梯度的加標實驗確定檢出限為0.1 μmol/L(23.9 μg/L)。與已報道的沙丁胺醇檢測方法以及原國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于保健食品中非法添加沙丁胺醇檢測標準相比(表1)，本文所構(gòu)建的適配體傳感器具有較低的檢出限，滿足對止咳平喘健康產(chǎn)品中非法添加沙丁胺醇的檢測需求。此外，本方法操作簡單，可用于現(xiàn)場檢測。

表1 不同分析方法檢測沙丁胺醇的比較Table 1 Comparison of methods for SAL detection

2.5 特異性實驗

圖3 傳感器的特異性實驗Fig.3 Specificity against CLB and RAP concentration of SAL,CLB and RAP is 10，1，1 mmol/L, respectively

克倫特羅(Clenbuterol，CLB)、萊克多巴胺(Ractopamine，RAP)與沙丁胺醇的分子結(jié)構(gòu)相似，都屬于β受體激動劑。因此用CLB和RAP考察傳感器的特異性。結(jié)果顯示，肉眼觀察濃度為1 mmol/L的CLB和RAP模擬樣品均未出現(xiàn)顯色反應(yīng)。紫外-可見分光光度法驗證結(jié)果如圖3，二者檢測結(jié)果吸光度與空白相近，可忽略不計，表明所研制傳感器特異性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

制備5批次傳感器，同時測定10 μmol/L沙丁胺醇，相對標準偏差(RSD)為3.6%；使用同一批傳感器，連續(xù)5 d測定10 μmol/L沙丁胺醇，RSD為 5.2%，說明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

表2 加標回收實驗結(jié)果Table 2 Results of recoveries

2.7 實際樣品中沙丁胺醇的檢測

為驗證所構(gòu)建傳感器檢測實際樣品的可行性，采用標準加入法檢測止咳平喘中成藥中沙丁胺醇的回收率。取某品牌聲稱具有平喘作用的中成藥，高效液相色譜法驗證其為沙丁胺醇陰性。取此中成藥1片(0.5 g)，研成粉末，去離子水充分溶解后離心，取上清液，制備低、中、高3個不同水平的沙丁胺醇(表2)加標樣品，進行實驗。結(jié)果顯示其回收率為86.0%～106%，RSD在15% 以內(nèi)，證明開發(fā)的適配體傳感器對實際樣品檢測具有應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本研究基于核酸適配體技術(shù)，通過大比表面積的二氧化硅微球固定SSB與HRP，達到信號放大作用，利用SSB與適配體結(jié)合的特點構(gòu)建傳感器“開關(guān)”，基于沙丁胺醇與SSB之間對適配體結(jié)合的競爭作用，最終借助磁性分離獲得游離SiO2@SSB@HRP并催化TMB產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化，建立了健康產(chǎn)品中非法添加沙丁胺醇的可視化檢測方法，檢出限為0.1 μmol/L。本方法具有快速、靈敏、肉眼可視、低成本且易操作的優(yōu)勢，可用于實際樣品中沙丁胺醇的可視化快速檢測。此外，只需改變適配體序列即可構(gòu)建針對其它目標物的檢測傳感器，進一步擴展此傳感器制備方法的應(yīng)用范圍。