楊莉莉，王婷婷，鮑昌昊，程 寒,*

(1.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.中南民族大學(xué) 民族藥學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 湖北 武漢 430074)

蘆薈大黃素(AE)化學(xué)名為1，8-二羥基-3-羥甲基蒽醌，屬于蒽醌類化合物，為橙色針狀結(jié)晶或土黃色結(jié)晶粉末，是一種從蘆薈、大黃及決明子等中藥材中提取的生物活性成分[1-2]。AE因具有清除氧自由基和抗腫瘤活性[3]、抗炎和抗菌活性[4]、降血壓[5]和免疫抑制作用[6]等多種藥理活性，而引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前已報(bào)道的AE檢測方法多為高效液相色譜法(HPLC)，如尚?；ǖ萚7]用HPLC法同時(shí)測定夏黃顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、厚樸酚、和厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，饒楠楠等[8]用HPLC法檢測蘆薈中8種蒽醌類物質(zhì)，潘家峰[9]比較了微乳液相色譜法(MELC)與常規(guī)HPLC法檢測大黃藥材中5種蒽醌類衍生物成分含量的效果，卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道用電化學(xué)方法檢測AE。而近年發(fā)展起來的電化學(xué)方法因具有靈敏度高、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)在很多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

納米金粒徑小于100 nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子、小分子結(jié)合，性質(zhì)穩(wěn)定[10-13]。用檸檬酸三鈉還原氯金酸得到的納米金粒子表面帶負(fù)電荷，通過電沉積方法可以使納米金在碳纖維超微電極表面形成帶負(fù)電荷的膜，從而制得表面帶負(fù)電荷膜的修飾電極[14-15]。

本文采用化學(xué)還原法即檸檬酸三鈉還原氯金酸制備了線狀納米金顆粒，通過電沉積方法將納米金修飾至碳纖維超微電極(CFME)，通過優(yōu)化電沉積時(shí)間，獲得穩(wěn)定性和電催化性能良好的修飾電極。該修飾電極對(duì)體系帶正電荷的AE有顯著的電催化作用，從而構(gòu)建了對(duì)AE電化學(xué)檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XD-RFL實(shí)驗(yàn)室倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；PTHW250ML型電熱套(武漢科爾儀器設(shè)備有限公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海儀器科學(xué)儀器股份有限公司)；Ag/AgCl電極為參比電極；CHI660D化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；JEOL-JSM-6500F掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子)。

碳纖維(直徑5 μm，吉林市神舟碳纖維有限責(zé)任公司)；氯金酸AuCl3·HCl·4H2O(純度≥47.8%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；AE(純度≥97%，上海源葉生物科技有限公司)；檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；碳粉導(dǎo)電膠(自制)；實(shí)驗(yàn)以pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液為底液，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 線狀納米金及修飾電極的制備

在圓底燒瓶中加入50 mL 0.01%的氯金酸溶液，置于電熱套中邊攪拌邊加熱直至沸騰，然后加入0.16 mL 1.0%的檸檬酸三鈉溶液，在攪拌下持續(xù)加熱直至溶液顏色不再變化，此時(shí)溶液呈藍(lán)紫色。

將Ag/AgCl電極和已制好的CFME放入適量線狀納米金溶膠中,在+1.5 V恒電位下進(jìn)行電沉積，使線狀納米金沉積于CFME表面，即在CFME表面形成納米金修飾層，將電極取出后用水清洗，得修飾好的碳纖維超微電極，記為LGN/CFME。

1.3 電化學(xué)測定

電化學(xué)檢測采用雙電極體系：以LGN/CFME為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極。差分脈沖伏安法(DPV)實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：電位掃描范圍-0.3～0.3 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.05 s，脈沖時(shí)間0.2 s，靜止時(shí)間20 s。實(shí)驗(yàn)過程均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 LGN/CFME對(duì)AE的電催化氧化

考察了電極修飾前后對(duì)1.0×10-4mol/L AE的電催化效果。將CFME置于線狀納米金溶膠(圖1A)中，于+1.5 V下電沉積12 min制得LGN/CFME。由掃描電鏡圖可見，未修飾的CFME(圖1B)表面光滑平整，修飾后其(圖1C)表面被一層納米金包裹，電極直徑略有增加，比表面積增大，可加快電極表面電子轉(zhuǎn)移速率，從而提高對(duì)AE的檢測效果。分別采用CFME和LGN/CFME在1.0×10-4mol/L AE中進(jìn)行循環(huán)伏安測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1D所示，氧化峰和還原峰均負(fù)移，其中前者Epa=-452 mV，Epc=-437 mV，ΔEp=15 mV(曲線a)；后者Epa=-510 mV，Epc=-440 mV，ΔEp=70 mV(曲線b)，說明AE在LGN/CFME上的電化學(xué)反應(yīng)可逆性增加，電子轉(zhuǎn)移速率增強(qiáng)，LGN對(duì)AE的氧化還原反應(yīng)具有良好的催化作用。

2.2 修飾電極電沉積時(shí)間的優(yōu)化

通過控制恒電位沉積的時(shí)間對(duì)線狀納米金的負(fù)載量進(jìn)行控制，即在線狀納米金溶液中于+1.5 V下分別恒電位沉積0、3、6、9、12、15、18 min，檢測1.0×10-4mol/L AE。結(jié)果如圖2所示，修飾后的電極較未修飾電極的氧化峰電流均有明顯增幅，隨著電沉積時(shí)間的增加，修飾至電極表面的納米金量增加，氧化峰電流不斷增加。當(dāng)電沉積時(shí)間達(dá)12 min時(shí)，峰電流增加幅度最大，此后，繼續(xù)延長電沉積時(shí)間，則氧化峰電流略有下降，增幅趨于平緩，可能是由于電沉積時(shí)間較長使得納米金在電極表面不斷聚集，從而導(dǎo)致電極表面的修飾層部分脫落，電極的電催化活性降低。進(jìn)一步考察不同電鍍時(shí)間得到的修飾電極的氧化峰電流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示，電鍍時(shí)間為12 min時(shí)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小(0.42%)。綜上，電極電沉積12 min時(shí)，修飾電極的電催化性能及穩(wěn)定性最佳，因此本實(shí)驗(yàn)均采用12 min為最佳電沉積時(shí)間。

圖1 線狀納米金的透射電鏡圖(LGN,A) 、碳纖維超微電極(CFME，B) 及納米金修飾碳纖維超微電極

圖2 1.0×10-4 mol/L AE在不同電沉積時(shí)間下的DPV曲線Fig.2 DPV curves of 1.0×10-4 mol/L AE at different deposition times deposition time(a-g) :0，3，6，9，12，15，18 min

2.3 掃速與pH值對(duì)氧化峰電流的影響

采用循環(huán)伏安法研究了電位掃描速率(v)對(duì)1.0×10-4mol/L AE在LGN/CFME上電化學(xué)行為的影響(圖3)。結(jié)果表明，掃描速率在50～1 000 mV/s范圍內(nèi)，AE的氧化峰電流(Ip，nA) 隨掃速增大而增大，且與掃速(v，mV/s)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為：Ip=0.794 2v+256.4，線性相關(guān)系數(shù)(r2)為0.989 2，表明AE在LGN/CFME上的氧化過程受擴(kuò)散控制?？紤]到掃描速率過快會(huì)增大充電電流，從而導(dǎo)致基線噪音變大，因此本實(shí)驗(yàn)均在100 mV/s下進(jìn)行。

分別用不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的Tris-HCl配制1.0×10-4mol/L AE溶液。在100 mV/s掃描速率下，考察了溶液在不同pH值下的循環(huán)伏安曲線(圖4)及其氧化峰電流與pH值的線性關(guān)系。結(jié)果表明，在此pH值范圍內(nèi)，AE的氧化峰電位Ep與pH值呈線性關(guān)系，其線性方程為Ep(mV)=564.8-26.82 pH,r2=0.955 4，說明AE的電極反應(yīng)中有質(zhì)子參與，且AE的氧化峰電位Ep隨pH值的增加而負(fù)移，說明AE的氧化是脫質(zhì)子的過程，在高pH值下氧化過程更易發(fā)生。而pH 5.0時(shí)AE的氧化峰電流最大，這是因?yàn)锳E在酸性溶液中被還原為蒽酚及其互變異構(gòu)體蒽酮，在CFME上有較高的電化學(xué)活性[16]。因AE在酸性溶液中易被還原，本實(shí)驗(yàn)均在pH 7.0下進(jìn)行。

圖3 1.0×10-4 mol/L AE在不同掃速下的CV圖Fig.3 CV curves of 1.0×10-4 mol/L AE at different scan rates scan rate (a-g):10,20,50,100,200,500,1 000 mV/s

圖4 1.0×10-4 mol/L AE在不同pH值下的CV圖Fig.4 CV curves of 1.0×10-4 mol/L AE in different pH values pH value (a-e):5.0,6.0,7.0,8.0,9.0

圖5 不同濃度AE在LGN/CFME的差分脈沖圖Fig.5 DPV curves of different concentration AE on LGN/CFME AE concentration(a-g):0.02,0.08,0.1,0.2, 0.5,0.8,1.0(×10-4 mol/L)

2.4 工作曲線的測定

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，檢測了不同濃度AE的DPV響應(yīng)曲線(見圖5)。結(jié)果顯示，隨著AE濃度的增加，其氧化峰電流(Ip，nA)增強(qiáng)，且與AE濃度(C，μmol/L)在2.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為Ip=0.318 1C+25.01，r2=0.965 3，檢出限(S/N=3)為6.19×10-7mol/L，說明此方法可用于AE的測定，且具有靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了一些常見物質(zhì)對(duì)AE測定的影響。當(dāng)AE濃度為1.0×10-4mol/L，在1.0×10-4mol/L的蘆薈多糖和蘆薈苷共存下，峰電流改變在±10%以內(nèi)，且峰電位偏移不超過±0.05 V，表明該修飾電極對(duì)AE的檢測具有良好的抗干擾能力。

2.6 實(shí)際樣品的分析

采用該修飾電極對(duì)實(shí)際蘆薈汁樣品中的AE含量進(jìn)行定量分析。采用10 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液將蘆薈汁液稀釋10倍，以標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)AE進(jìn)行檢測。加入AE的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為5.00、10.00、15.00、20.00、30.00 μmol/L。結(jié)果測得加標(biāo)回收率為95.5%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5.0%(見表1)，表明該修飾電極可實(shí)現(xiàn)蘆薈汁中AE的定量分析。

表1 蘆薈汁中AE含量的測定(n=5)Table 1 Determination results of AE in aloe juice(n=5)

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3 結(jié) 論

本文提出了一種AE的電化學(xué)檢測方法，通過檸檬酸三鈉還原氯金酸制備了線狀納米金，采用一步恒電位沉積的方法在CFME上沉積納米金，用循環(huán)伏安法和差分脈沖法考察了LGN/CFME對(duì)AE的電催化氧化性能。該修飾電極對(duì)AE有明顯的電催化作用，檢出限達(dá)6.19×10-7mol/L。該檢測方法簡便、靈敏度高，修飾電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，易制備，可用于AE的定量檢測。