李 莎，王 露，王 迎，陳 平

(湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081)

可逆蛋白質(zhì)磷酸化是由特定蛋白激酶和磷酸酶調(diào)控[1-2]的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post translational modification，PTM)方式之一，參與調(diào)節(jié)機體生命活動的全過程，如生長發(fā)育、增殖、凋亡及分化等[3-5]。在真核生物中有1/3的蛋白質(zhì)與磷酸化修飾相關(guān)[6]，主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基側(cè)鏈的羥基上，且磷酸化絲氨酸(pSer)、磷酸化蘇氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的比例為1 800∶200∶1[7]。鑒于蛋白質(zhì)磷酸化修飾的重要性，基于質(zhì)譜的多種方法被用于蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定[8]。然而，磷酸化修飾豐度低、高動態(tài)性以及非磷酸化肽段的信號抑制等因素極大地限制了其質(zhì)譜鑒定[9]。因此，針對質(zhì)譜分析前磷酸化肽的分離純化，是深入研究磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的必要條件。

本文綜述了多種磷酸化肽段富集方法，包括固相金屬離子親和色譜法(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)[10-12]、金屬氧化親和色譜法(Metal oxide affinity chromatography，MOAC)[13-15]、親水相互作用色譜法(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)、靜電排斥親水相互作用色譜法(Ectrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography，ERLIC)、化學(xué)衍生法[16]、強陽/陰離子交換色譜法(Strong cation/anion exchange chromatography，SCX/SAX)以及基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)靶盤富集法等(圖1)。鑒于磷酸化蛋白質(zhì)組的多樣性和復(fù)雜性，以及不同方法對肽段的偏愛性差異，目前沒有一種方法可以富集到所有磷酸化肽。因此多種分離富集方法相結(jié)合被用于磷酸化肽段分析，以提高磷酸化修飾鑒定效率。

圖1 磷酸化肽段富集方法Fig.1 Enrichment method of phosphopeptide

1 色譜分離富集法

1.1 固相金屬離子親和色譜法

固相金屬離子親和色譜法(IMAC)這一概念首次由Porath等[17]提出，主要利用帶正電荷的金屬離子吸附帶負(fù)電荷的磷酸基團。常用金屬離子包括Fe3+、Ga3+[18]、Al3+、Zr4+[19]以及Ti4+[20]等。傳統(tǒng)的IMAC材料制備條件苛刻，且耗時耗力。隨著材料相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，IMAC材料也不斷創(chuàng)新，制備技術(shù)趨于成熟。如Wang等[21]采用紫外光引發(fā)聚合法制備Zr4+-IMAC單體，該方法制備方便，耗時短，且Zr4+-IMAC單體易于再生，富集結(jié)果重現(xiàn)性好?；谠摲椒▋?yōu)化的微芯片樣式Zr4+-IMAC單體不僅對磷酸化肽段具有較高的選擇性，而且與基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)具有很好的兼容性。隨后，Wang等[22]改變傳統(tǒng)的IMAC材料制備方法，制備了一種無螯和配體的新型共價有機骨架-IMAC材料(TpPa-2-Ti4+)，對磷酸化肽段檢出限可達(dá)4 fmol。隨著科技的發(fā)展，具有超級特異性的新一代Ti4+-IMAC[23-26]相繼被研發(fā)，與傳統(tǒng)的Fe3+-IMAC相比，這類新型Ti4+-IMAC富集磷酸肽具有高特異性、高富集效率等特點[27]。IMAC的主要缺點是金屬離子與具有酸性氨基酸的非磷酸肽會發(fā)生非特異性結(jié)合，且富集后含有大量生物試劑，因此質(zhì)譜鑒定前需進行脫鹽處理，在一定程度上會造成樣品量損失，且該法易受pH值、柱基質(zhì)、上樣/洗脫步驟等影響。最近，Zhu等[28]報道了一種pH/甘草磷控制的Fe3+-IMAC富集法，通過選擇合適的pH值與甘草磷組合，可有效洗脫單磷酸及多磷酸化肽段，與常用洗脫緩沖液相比，MALDI-TOF質(zhì)譜檢測中磷酸化肽段的信噪比可提高3～5倍，且磷酸化多肽的回收率顯著提高。Piovesana等[29]以1 mol/L乙酸和0.4 mol/L檸檬酸鈉為緩沖液，在pH 9.0條件下有效提高了磷酸化肽段的洗脫率。研究表明，50%乙腈、0.1%三氟乙酸可增強β-酪蛋白酶解后磷酸化肽段與Nb5+-IMAC的結(jié)合力[30]。

1.2 金屬氧化親和色譜法

MOAC主要利用樹脂中金屬原子對磷酸基氧的高親和力而使磷酸肽得到富集。最常用的材料為TiO2，除此之外，ZrO2[31]、SiO2[32]等也可用于磷酸化肽段富集。Pinkse等[33]首次將TiO2用于蛋白質(zhì)酶解后磷酸化肽段富集，進一步研究發(fā)現(xiàn)其適用于從復(fù)雜樣本中富集磷酸化肽[34-35]。Sun等相繼制備了2種用于高效吸附磷酸化肽和糖肽的磁性納米材料，一種是親水三肽包被磁性TiO2的多功能納米復(fù)合材料Mag TiO2-GSH[36]，一種是巰基琥珀酸改性介孔TiO2包被Fe3O4的親水性磁性納米材料Fe3O4@mTiO2-MSA[37]。Zhu等[38]對傳統(tǒng)TiO2進行改性，采用溶膠-凝膠法合成了一種具有更大比表面積的新型TiO2/Bi/Fe/Zr納米材料，對磷酸化肽段的檢出限可達(dá)4×10-10mol/L。Wang等[39]基于生物材料花粉(Pollen grains，PGs)表面積大、顆粒均勻等特性，合成了一種用于磷酸化肽富集的新型雙金屬氧化物MOAC復(fù)合材料(PGs@(Ti-Zr)O4)，該材料具有選擇性高(β-酪蛋白-BSA=1∶1 500)、檢出限低(0.1 fmol)等特點。隨著材料科學(xué)的進步，摻雜磁性納米顆粒的MOAC新型材料也不斷向前發(fā)展，如聚酰亞胺-FexOy-ZrO2[31]、Fe3O4@PDA@MIL-125@Au@L-Cys[40]、Fe3O4@SiO2-磁性納米顆粒[24]、Fe3O4@H-fTiO2[41]等納米復(fù)合材料在磷酸化肽段富集方面表現(xiàn)出較高的富集效率。

MOAC富集效率易受富集體系中不同試劑成分、緩沖液pH值等的影響。因此，復(fù)雜生物樣本中選擇性富集磷酸化肽段成功與否的關(guān)鍵在于能否盡可能降低非磷酸化肽的干擾。對于富集條件的優(yōu)化，如采用含乳酸[42]、鄰苯二甲酸[43]的洗滌緩沖液，以及含磷酸銨[44]和吡咯烷[45]的洗脫緩沖液，或者是在富集體系中添加2,5-二羥基苯甲酸[46]等，均可改善TiO2的非特異性吸附問題。Fukuda等[47]采用甘油添加劑同時聯(lián)合NH4OH和雙丙烷洗脫緩沖液，提高了TiO2對單磷酸化肽的選擇性富集效率，在PC3細(xì)胞中鑒定出8 300個磷酸化位點，對應(yīng)2 600個磷酸化蛋白。Klement等[48]發(fā)現(xiàn)離子濃度較低的洗脫緩沖液可有效抑制非磷酸化肽段的吸附，從而洗脫出較多的磷酸化肽段。

比較MOAC和IMAC在內(nèi)的各種磷酸化肽富集方法產(chǎn)生的磷酸化數(shù)據(jù)庫，可發(fā)現(xiàn)目前還沒有一種磷酸化肽富集方法能夠完全覆蓋整個磷酸化蛋白質(zhì)組?？朔@種方法偏差的策略是結(jié)合多種富集技術(shù)來提高磷酸化蛋白質(zhì)組的覆蓋范圍。

1.3 SCX/SAX富集法

鑒于組織樣本的復(fù)雜性，直接進行磷酸化修飾分析充滿挑戰(zhàn)，因此有必要對磷酸化多肽進行分離富集。SCX[49-50]分離富集原理是使帶負(fù)電的磷酸化肽段流過帶負(fù)電官能團的固定相時，由于靜電排斥作用，較早的被洗脫出來。而SAX與SCX作用機制相反，磷酸肽可較強的吸附在陽離子固定相中。

SCX是目前常用的高效液相色譜分離方法之一，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中也有應(yīng)用。在酸性pH值中，胰酶酶解的肽段大多數(shù)帶電荷量為+2，而磷酸化肽段由于含有一個帶負(fù)電荷的磷酸基團，從而使其帶電荷為+1，尤其是多磷酸位點的肽段會在SCX的早期分餾物中被洗脫出來[50]。

帶負(fù)電荷的磷酸化肽比非磷酸化肽具有更強的酸性，更適合用SAX[51]分離富集。研究表明，SCX主要是吸附一些高親水性的以及一些堿性磷酸化肽(pI>8.0)，而SAX吸附的磷酸化肽段pI為2.91～6.45，其中有少部分為強酸性磷酸化肽段(pI<3.0),同時，一些強酸性的非磷酸化肽會與磷酸化肽一起被洗脫[49]。若胰酶酶解不充分也會產(chǎn)生一些內(nèi)源性精氨酸與賴氨酸，從而造成磷酸化肽帶電荷量>1，不與磷酸化肽一起洗脫?；赟CX/SAX分離富集磷酸化肽的特點，Dehghani等[52]將SCX/SAX用于Hela細(xì)胞裂解物磷酸化肽段的富集，其中SCX法鑒定出9 812個磷酸化位點，對應(yīng)3 674個磷酸化蛋白，而SAX鑒定出3 950個磷酸化位點，對應(yīng)2 392個磷酸化蛋白。

1.4 其它色譜富集法

近年來，HILIC因可以避免質(zhì)譜鑒定前脫鹽等過程造成的樣品損失，與質(zhì)譜儀具有良好的兼容性[53]，被越來越多的作為SCX/SAX的替代方法[45,54]。然而，相關(guān)研究表明，HILIC對多磷酸化肽的分辨率要低于單磷酸化肽[55]。

ERLIC可與其它分離富集技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究[56-57]，其分離富集磷酸化肽基本原理是:在離子交換色譜中，流動相為有機溶劑(如70%乙腈)，帶負(fù)電荷的磷酸基團會與色譜填料柱發(fā)生靜電相互作用，而流動相中的有機溶劑會增強磷酸化肽段的親水相互作用，從而將磷酸化肽段與非磷酸化肽段分離。ERLIC對復(fù)雜樣本中磷酸化肽段以及N-糖肽的成功分離富集，引起了學(xué)者們對于LC-MS鑒定前磷酸化肽段預(yù)分離技術(shù)的關(guān)注[58]。如Loroch等[59]將高靈敏度的ERLIC-SCX/RPLC-MS法用于微克級的Hela細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定；Hao等[60]將ERLIC與RPLC-MS/MS相結(jié)合，應(yīng)用于大鼠腎臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在近3 000個蛋白質(zhì)中鑒定出583個磷酸化位點。

2 化學(xué)衍生法

β-消除反應(yīng)原理是兩個相鄰碳原子上分別消除一個原子或原子團，生成一個不飽和鍵的過程。1986年，Meyer等[61]首次將β-消除/邁克加成反應(yīng)用于cAMP底物Kemptide蛋白磷酸化絲氨酸修飾的鑒定。β-消除/邁克加成反應(yīng)作為一種磷酸化修飾分析新策略，利用親核取代防止磷酸基團的中性損失，克服了現(xiàn)存磷酸化富集方法的局限性[62]。Chen等[63]在β-消除/邁克加成反應(yīng)過程中，引入硫代膽堿，將帶負(fù)電荷的磷酸肽轉(zhuǎn)換為帶正電荷的四元季銨鹽，使電噴霧離子源質(zhì)譜(檢出限低于500 amol/L檢)電離效率增加了100倍。進一步研究表明，以胍二硝基乙硫醇[64]和三甲胺半胱胺鹽酸鹽[63]為加成試劑，均可優(yōu)化質(zhì)譜鑒定結(jié)果。當(dāng)磷酸化蘇氨酸位置接近脯氨酸時，采用2-氨基乙烷硫醇或者其它硫醇邁克加成試劑，可有效轉(zhuǎn)化磷酸化肽段，提高富集效率并減少樣品量損失[65-66]。

然而，β-消除/邁克加成反應(yīng)也存在缺點。首先，該方法涉及多步反應(yīng)，副產(chǎn)物多以及反應(yīng)不完全現(xiàn)象會增加樣品的復(fù)雜性；其次，親和反應(yīng)添加的Cα不具有立體專一性，會導(dǎo)致非對映體混合物的形成[67]，從而會影響質(zhì)譜對磷酸化肽的鑒定效率。為解決這些問題，研究者通過引入二硫化基或堿基等不穩(wěn)定基團提高磷酸化肽的富集效率[16]。如Nika等[65]通過在Michael受體反應(yīng)體系中添加EDTA達(dá)到抑制副反應(yīng)產(chǎn)生的目的。

3 MALDI靶盤富集法

常規(guī)磷酸化肽富集方法均是在溶液中完成，富集過程涉及離心、脫鹽等繁瑣步驟，易導(dǎo)致樣品丟失，限制了其在微量磷酸化肽檢測中的應(yīng)用。

為了減少樣品損失并對微量樣品進行鑒定，可通過化學(xué)修飾MALDI靶盤實現(xiàn)對磷酸化肽段的原位富集，之后直接進行質(zhì)譜分析[68]。這種MALDI靶盤原位富集法所需樣品量少，在減少樣品量損失的同時，實現(xiàn)了對低豐度磷酸化肽段的鑒定。最近研究表明，盡管TiO2或Ti4+-PDA修飾MALDI靶盤[68-69]富集過程耗時短，樣品損失量少，但在溶劑蒸發(fā)期間由于納米顆粒電離與聚集的不穩(wěn)定性，會造成TiO2形態(tài)以及厚度難以控制，印刷、噴涂、煅燒等過程也會導(dǎo)致TiO2損失，此外MALDI靶盤昂貴的價格也限制了此類方法的應(yīng)用。為了克服這些問題，已有報道采用鋁箔[70]、載玻片[71-72]來替代商業(yè)化MALDI盤。如Lin等[68]采用原子層沉積(Atomic layer deposition，ALD)法將NH2修飾的TiO2共價偶聯(lián)到MALDI靶盤，同時實現(xiàn)了TiO2形態(tài)和厚度的有效控制及磷酸化肽的富集；Wang等[73]采用脈沖激光淀積(Pulse layer deposition，PLD)法將多孔TiO2納米顆粒偶聯(lián)到MALDI靶盤上，并在TiO2表面修飾十八烷基三氯硅烷(Octadecyl trichlorosilane，OTS)，極大地提高了磷酸化肽段鑒定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。Chen等[74]將聚二甲硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)偶聯(lián)到MALDI靶盤，增強了樣本的靈敏度和均一性，使得鑒定到的多肽信號比未修飾的MALDI靶盤增強了7.1～11倍。隨后，該課題組[75]在此基礎(chǔ)上，將PDMS偶聯(lián)的MALDI靶盤與TiO2結(jié)合，這種二氧化鈦-聚二甲硅氧烷MALDI靶盤(TP)具有樣品重復(fù)性良好、樣品損失率低以及樣本兼容性高等特點，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中具有很好的應(yīng)用前景。

4 多種方法結(jié)合

4.1 多維色譜技術(shù)

單獨采用某方法時，獲得的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)是有限的。研究表明，將SAX、SCX、HILIC、ERLIC與反相液相色譜法(Reversed phase liquid chromatography，RPLC)相結(jié)合，可以顯著降低樣品的復(fù)雜程度，從而增加磷酸化肽段的有效濃度[59]。因此多種技術(shù)串聯(lián)富集磷酸化肽的方法逐漸受到重視。

可根據(jù)磷酸化肽段疏水性、帶電荷狀態(tài)及親水性對分離富集方法進行優(yōu)化，多種色譜方法相結(jié)合可解決不同理化性質(zhì)磷酸化肽段分離富集方面所存在的問題，SCX-RPLC-MS/MS是大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的分離富集技術(shù)[76]。

Link等[77]首次采用多維色譜分離技術(shù)SCX-RPLC分析磷酸化蛋白質(zhì)組，此外，SCX/SAX多維反相液相色譜可以有效保留磷酸化肽，增加嗜堿性和嗜酸性激酶底物中陰離子和陽離子磷酸化肽的覆蓋范圍[49]。

在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，磷酸化肽段含量低，質(zhì)譜檢測靈敏度差等特點，使得實驗所需樣本一般需達(dá)到毫克級別。為克服這些局限性，Loroch等[59]采用結(jié)合SCX的多維質(zhì)譜鑒定技術(shù)(ERLIC-SCX/RPLC-MS)從100 mg Hela細(xì)胞酶解物中鑒定出7 500多個磷酸化位點，對應(yīng)3 013個磷酸化蛋白。與MOAC-Ti4+富集法相比，ERLIC-SCX/RPLC-MS可富集到較長的酸性磷酸肽，在大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中有良好的應(yīng)用前景。隨后，該課題組[78]又將二維ERLIC-SCX/RPLC-MS磷酸化肽段富集方法細(xì)化為覆蓋全局蛋白質(zhì)組學(xué)的3-D工作流，并成功用于小鼠巨噬細(xì)胞病毒感染小鼠成纖維細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。與2-D富集技術(shù)相比，3-D工作流具有樣品半自動化處理潛力，在臨床和生物醫(yī)學(xué)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

4.2 多維色譜與MOAC/IMAC法相結(jié)合

目前磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，SCX與IMAC方法相結(jié)合得到了廣泛應(yīng)用[79]。然而SCX-IMAC分離富集磷酸化肽過程中，酶解、凍干、脫鹽等繁瑣流程易導(dǎo)致樣品損失。Yue等[80]通過優(yōu)化SCX-IMAC方法，采用multi-IMAC-HLB從3 mg樣本中鑒定出8 969個磷酸化肽段，而SCX-IMAC從15 mg樣品中僅鑒定出5 519個磷酸化肽段。Carrera等[50]開發(fā)了一種用于生成大規(guī)模磷蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)集(<15 h)的快速分析方法，即HIFU-TiO2-SCX-LC-MS/MS，克服了以往SCX-IMAC分離富集過程耗時耗力的缺陷。

在多維色譜分離系統(tǒng)中，HILIC是最理想的一維分離系統(tǒng)。如Zappacosta等[81]根據(jù)磷酸基團的親水性以及磷酸化肽段在親水相中的保留度，將HILIC作為IMAC的預(yù)分離技術(shù)從而降低樣品復(fù)雜性，從500 mg大鼠肝臟樣品中富集鑒定出16 000個磷酸化位點。SIMAC(Sequential elution from IMAC)是一種高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，可從多磷酸化肽中分離出單磷酸化肽，提高復(fù)雜樣品中多磷酸化肽的鑒定數(shù)量[82]。此外，SIMAC、HILIC與TiO2多種技術(shù)相結(jié)合可用于微克級胰島素瘤細(xì)胞裂解物全局磷酸化肽段的鑒定[83]。

酪氨酸由于磷酸化水平較低，常規(guī)富集方法對磷酸化酪氨酸無特異性，因此需要基于抗體開發(fā)的方法才可達(dá)到對磷酸化酪氨酸的選擇性富集[84]。如Abe等[85]通過優(yōu)化常規(guī)磷酸化酪氨酸富集方法，采用磷酸化酪氨酸抗體免疫沉淀法(pY-IP)與Fe3+-IMAC兩步富集磷酸化酪氨酸，從8 mg PC3細(xì)胞裂解物中鑒定出1 000多個酪氨酸磷酸化位點，這種磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)組學(xué)方法具有揭示未知pY信號模式和識別新型激酶抗癌靶點的潛力?；诳贵w開發(fā)的磷酸化酪氨酸富集法不斷創(chuàng)新，Iliuk等[86]開發(fā)出的一種高靈敏度的新型蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具即基于聚合物的金屬離子親和捕獲(PolyMAC)-抗體組合型方法，在酪氨酸磷酸化所參與的信號通路研究中具有良好的應(yīng)用前景。

然而，多種方法相結(jié)合富集磷酸肽的過程不僅費時費力，也會造成低豐度磷酸化肽損失。為避免這些方法在磷酸化肽段富集方面存在的偏差，需開發(fā)一種不同富集技術(shù)結(jié)合的新型雜合材料，簡化操作流程。基于MOAC與IMAC對磷酸化肽段偏愛性不同的特點，Yang等[87]設(shè)計開發(fā)了一種多功能納米材料Fe3O4@nSiO2@mSiO2/TiO2-Ti4+，該材料具有較高的比表面積(179.3 m2/g)和吸收性能(133 mg/g)，質(zhì)譜檢測靈敏度可達(dá)4 pmol。Wang等[88]制備了一種吡啶醛5′-磷酸鹽介導(dǎo)的固定化金屬親和材料即Fe3O4@SiO2-PLP-Ti4+，減少了非磷酸化肽的非特異性吸附，促進了磷酸化肽段的選擇性吸附。

5 展 望

在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中，優(yōu)化磷酸化肽段分離富集方法并不是提高磷酸化蛋白質(zhì)鑒定效率的唯一選擇。有研究報道質(zhì)譜可提高磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定效率[6,89]，但在質(zhì)譜鑒定前生物樣本的動態(tài)變化導(dǎo)致樣品變得復(fù)雜。因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究重點之一是開發(fā)高選擇性的樣品制備工具，用以富集磷酸化肽和蛋白質(zhì)。

隨著磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，對于磷酸化肽段的分離純化技術(shù)要求也不斷增長。樣品濃縮技術(shù)必須朝著避免目標(biāo)產(chǎn)物損失，減少干擾分子非特異性富集方向發(fā)展。如本文所提到的一些分離富集方法對于減少非特異性磷酸化肽段的非特異性結(jié)合具有良好的效果。

現(xiàn)如今由于質(zhì)譜儀檢測范圍有限，在濃度較低的磷酸化肽段檢測方面經(jīng)常受到阻礙。因此，未來磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究必須致力于提高質(zhì)譜檢測靈敏度，以便能追蹤到與疾病相關(guān)的一些含量較低的磷酸化蛋白質(zhì)，這也意味著需研究開發(fā)高靈敏度的樣品制備方法，用于富集豐度較低的目標(biāo)分子。