李宇翔， 李燕平， 李少光， 楊 艷

中國(guó)是世界上第一產(chǎn)茶葉大國(guó)，茶葉產(chǎn)品暢銷國(guó)內(nèi)外。但是近年來(lái)茶葉農(nóng)藥殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重，同時(shí)國(guó)際市場(chǎng)尤其是歐盟和日本這兩大市場(chǎng)卻啟用了更嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，使農(nóng)藥殘留成為茶葉出口的主要限制因素。雖然氟蟲腈在茶樹上未被登記使用過(guò)，但卻在出口茶葉中多次檢出[1]。2017年荷蘭毒雞蛋事件發(fā)生后，氟蟲腈成為歐美國(guó)家重點(diǎn)關(guān)注的農(nóng)藥殘留之一，日本市場(chǎng)甚至對(duì)我國(guó)的烏龍茶實(shí)施氟蟲腈重點(diǎn)檢查[1]。

氟蟲腈是一類苯基吡唑類廣譜殺蟲劑，由于其具有殺蟲類別廣，殺蟲效果好，時(shí)效長(zhǎng)，不影響作物生長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)被廣泛用作多種作物的殺蟲劑[2]。氟蟲腈穩(wěn)定性較差，在使用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜等。氟蟲腈及其代謝物的大劑量的攝入會(huì)造成人體肝功能、甲狀腺及腎臟損傷[3]。研究表明，作為代謝物之一的氟蟲腈砜對(duì)淡水生物的毒性比氟蟲腈高6倍以上[4]。因此，測(cè)定氟蟲腈的同時(shí)也需要測(cè)定其代謝產(chǎn)物。

我國(guó)也逐漸重視氟蟲腈的測(cè)定。目前文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定茶葉中氟蟲腈的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[4-10]。文獻(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)UPLC-Q-Exactive法測(cè)定茶葉中的氟蟲腈及其代謝物。因此，本研究旨在建立運(yùn)用較為成熟的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法[11-12]，與UPLC-Q-Exactive儀器聯(lián)用，通過(guò)一級(jí)全掃(full mass spectrometry/target-select iron monitoring，F(xiàn)ull MS/t-SIM)定量，二級(jí)平行監(jiān)測(cè)(parallet-reaction-monitoting，PRM)進(jìn)行定性分析，快速、準(zhǔn)備、靈敏地檢測(cè)和篩查出茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑 氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：7783741)、氟甲腈標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：4427363)、氟蟲腈砜標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：160021)、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：4092033)均購(gòu)自美國(guó)迪馬公司；氯化鈉(批號(hào)：20170413)、無(wú)水硫酸鈉(批號(hào)：20180615)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺(PSA)(批號(hào)：030982-TE)、C18粉(批號(hào)：030982-TE)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；乙腈、甲醇均購(gòu)自德國(guó)默克公司。

1.1.2儀器 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo UltiMate 3000 UPLC-Q Exactive，美國(guó)Thermo公司)；離心機(jī)(ALLEGRA X-30，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；純水機(jī)(MILLIPORE Milli-Q8，美國(guó)Milli-pore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1樣品處理 通過(guò)優(yōu)化文獻(xiàn)方法[13]，將商品化的茶葉樣品攪碎至粉末狀，再稱取茶葉樣品2 g于50 mL離心管中，加20 mL乙腈，渦旋混勻30 s，超聲提取15 min，加入2 g氯化鈉和6 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋2 min，9 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入50 mg PSA粉末、50 mg C18粉末和250 mg無(wú)水硫酸鈉，渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL加水0.5 mL，渦旋30 s，過(guò)0.25 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)定。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.2.1氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用乙腈溶解并定容于100 mL量瓶，終濃度為100 mg/L。氟蟲腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L)，用乙腈溶解并定容于100 mL量瓶，終濃度為100 μg/L。

1.2.2.2氟蟲腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白基質(zhì)溶液配制成濃度為0.1，0.2，0.5，1，2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，臨用現(xiàn)配。

1.2.3儀器條件

1.2.3.1色譜條件 色譜柱：Thermo Syncronis C18柱( 100 mm×2.1 mm，1.7 μm )；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相 A為甲醇，B為純水溶液，梯度洗脫程序：0 ～0.5 min，90%A；0.5～2.5 min，90% ～ 5%A；2.5～4 min，5%A；4～4.1 min，5%～90%A；4.1～6 min，90%A。

1.2.3.2質(zhì)譜條件 掃描模式1：Full MS/t-SIM(150～2 000 m/z)；分辨率：70 000；采集極性：Negative；AGC target：1e6；Maximun IT：50 ms；電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；毛細(xì)管溫度320 ℃；噴霧電壓：3.20 kV；鞘氣流速：40 arb；輔氣流速：15 arb。掃描模式2：PRM(200～800 m/z)；分辨率：17 500；采集極性：Negative；AGC target：2e5；Maximun IT：100 ms。

2 結(jié) 果

2.1氟蟲腈及其代謝物的定性鑒定 通過(guò)Full MS/t-SIM和PRM對(duì)氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性考察，獲得其實(shí)際精確母離子和子離子質(zhì)核比信息、色譜峰的保留時(shí)間，快速初篩出空白基質(zhì)樣品[14]。兩種模式下基質(zhì)空白圖譜見圖1，2，未檢出任何峰型信息。氟蟲腈及其他3種化合物的相關(guān)文獻(xiàn)信息及質(zhì)譜測(cè)定信息見表1。測(cè)得實(shí)際精確分子量與理論精確分子量的偏值均<5×10-6，可以確認(rèn)為目標(biāo)化合物。

表1 氟蟲腈及其代謝物高分辨質(zhì)譜鑒定參數(shù)表

△：質(zhì)量偏差P等于理論值T與實(shí)際值的差值與理論值的比值．

2.2線性、檢出限及定量限 按照1.2項(xiàng)下方法做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0.1～2 μg/L，其中Full MS Scan Type(線性ya)的相關(guān)系數(shù)為0.996 0～0.997 6，PRM Scan Type(線性yb)的相關(guān)系數(shù)為0.995 9～0.999 8。計(jì)算當(dāng)信噪比為3倍(S/N≥3)時(shí)的溶液濃度為檢出限，信噪比為10倍(S/N≥10)時(shí)的溶液濃度為定量限。兩種不同檢測(cè)模式的檢出限和定量限見表2。兩種掃描模式的標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)色譜及質(zhì)譜圖見圖3，4。

表2 氟蟲腈及其代謝物線性關(guān)系、范圍、檢出限以及定量限

y：標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)響應(yīng)值；x：標(biāo)準(zhǔn)品含量；LODs：檢出限；LOQs：定量限．

2.3回收率、精密度 通過(guò)使用前期篩查的空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每種化合物分別添加3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(0.5，1.0，2.0 μg/kg)，每個(gè)平行測(cè)定6次(n=6)，按2.1項(xiàng)下處理方法進(jìn)行處理，并進(jìn)質(zhì)譜分別進(jìn)行Full MS/t-SIM和PRM模式的定性定量分析，結(jié)果見表3。Full Mass掃描模式下測(cè)得氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為90.2%～106.7%，RSD值為2.035%～5.438%；PRM模式下的平均回收率為92.0%～103.2%，RSD值為1.075%～5.930%。

2.4實(shí)際樣品測(cè)定 按食品抽樣方法，隨機(jī)抽取全省190份茶葉樣品,按1.2.1～1.2.3項(xiàng)下處理方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。用氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性定量。結(jié)果表明，190份樣品檢出43份(按本方法的檢出限計(jì)算，包含超出國(guó)家限量指標(biāo))，一級(jí)母離子精確質(zhì)量偏差<5×10-6，陽(yáng)性樣品Full MS質(zhì)譜圖見圖5，質(zhì)譜圖見圖6。

表3 氟蟲腈及其代謝化合物的回收率、精密度

Tab 3 The average recovery, precision of fipronil and its metabolites in tea

化合物加標(biāo)濃度(μg·kg-1)平均回收率/%Full MS PRM相對(duì)偏差RSD/%Full MSPRM氟蟲腈0.592.995.43.7493.4581.090.292.02.0351.6212.094.195.63.0675.930氟甲腈0.596.992.33.1102.6531.091.795.82.7621.0752.090.793.82.6081.846氟蟲腈砜0.596.4101.94.1701.5741.0103.097.05.4382.4182.0105.9101.03.8323.748氟蟲腈亞砜0.597.993.42.8193.6031.0101.4103.03.7425.0182.0106.7103.24.9032.809

n=6. Full MS：一級(jí)全掃；PRM：二級(jí)平行監(jiān)測(cè)．

3 討 論

由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性及涉及多組分、同類型化合物結(jié)構(gòu)的相似性，普通低分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀無(wú)法準(zhǔn)確分離定性，因而常出現(xiàn)假陽(yáng)性。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已無(wú)法滿足日常的檢測(cè)要求。高分辨質(zhì)譜儀在一定程度上彌補(bǔ)了這個(gè)缺陷，被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)藥的快速篩查[15]。Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀通過(guò)四極桿與Obitrap串聯(lián)，提高了定性能力，同時(shí)其定量能力達(dá)到了三重四極桿的定量效果[16]。本方法基于四極桿-靜電場(chǎng)/軌道阱質(zhì)譜的高分辨能力，可有效地排除樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響，與傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀相比，其分辨率高，對(duì)化合物的質(zhì)核比能夠精確至小數(shù)點(diǎn)后5位，具有排他性，因而可以進(jìn)行準(zhǔn)確的一級(jí)定量。同時(shí)本方法也對(duì)樣品進(jìn)行PRM模式的測(cè)定，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性樣品精確的二級(jí)子離子掃描(子離子m/z精確至小數(shù)點(diǎn)后5位)，進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行確證，從而消除假陽(yáng)性的可能性。兩種掃描模式的聯(lián)合運(yùn)用，保證了方法的定量準(zhǔn)確和定性可靠。結(jié)果表明，本方法分析時(shí)間短，靈敏、準(zhǔn)確，檢出限均能達(dá)到0.02 μg/L，可以滿足各種茶葉中氟蟲腈及其3種代謝物的快速測(cè)定要求，有一定的推廣價(jià)值。但是由于本研究篩查組分少，未考慮流動(dòng)相及色譜柱的選擇，并且氟蟲腈及其代謝物在4 min同時(shí)出峰，考慮后期加入更多的組分，在之后的試驗(yàn)應(yīng)逐步優(yōu)化色譜條件，提高儀器的效率及分辨能力。