馮海洋 劉卓 付志璇

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率居高不下，在全世界位居第三，我國發(fā)病率和死亡率也逐年升高[1-2]。對(duì)于結(jié)腸癌的治療，目前采用以外科手術(shù)為主、化療為輔的綜合治療方式，但是療效并不理想，且藥物毒副反應(yīng)較大，腫瘤耐藥明顯，對(duì)患者的生存率提高不明顯[3]。此外，臨床上很大一部分患者在診斷結(jié)腸癌時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，治療困難?？梢?，結(jié)腸癌的預(yù)后與是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。因此，針對(duì)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究及藥物研究，是當(dāng)前結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。桑寄生富含茶酸、齊墩果酸、香樹脂醇、黃酮類化合物、槲皮素和凝集素等有效成分，目前已被證實(shí)具有抗腫瘤、降血壓、消炎鎮(zhèn)痛及保護(hù)神經(jīng)等作用[5]。為進(jìn)一步探討桑寄生的抗腫瘤作用機(jī)制，本研究就桑寄生提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及侵襲遷移的影響作一探討，并闡釋其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所）。桑寄飲片（安徽淮濤中藥片科技有限公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，日本同仁化學(xué)公司）；侵襲小室（Transwell）及基質(zhì)膠Matrigel（美國BD公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及SDS-PAGE膠試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP-2）、MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、鼠抗人AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K抗體（美國 Abcam公司）；GAPDH、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（杭州華安生物有限公司）；ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒（美國賽默飛公司）。

1.2 桑寄生提取物制備 稱取桑寄生飲片1 000g，蒸餾水沖洗2次，加入5 000g蒸餾水浸泡1h，文火煎煮30min；過濾，取濾液，殘?jiān)尤? 000g蒸餾水繼續(xù)煎煮30min；再次提取濾液，合并兩次濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100ml膏狀提取物（相當(dāng)于每ml含桑寄生藥材10g），置于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)驗(yàn)前取桑寄生提取物，用培養(yǎng)液倍比稀釋制備相應(yīng)實(shí)驗(yàn)濃度，0.22μm無菌濾器過濾后使用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清、100g/L青霉素及100g/L鏈霉素）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-2細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期進(jìn)行傳代及實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將對(duì)數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，以3 000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分為6組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；吸取上清后，6 組分別在每孔加入 0、0.5、1、2、4、8g/ml濃度的桑寄生提取物100μl；分別于加藥24、48、72h后，加入CCK-8試劑（10μl/孔），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。利用分光光度計(jì)檢測(cè)各孔在550nm的吸光度（OD值），細(xì)胞存活率（%）=OD 值加藥組/OD 值空白對(duì)照組×100%，并計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell法。用無血清DMEM培養(yǎng)液按3∶1比例稀釋基質(zhì)膠，取30μl基質(zhì)膠稀釋液均勻包被Transwell小室，于4℃過夜、風(fēng)干，置于24孔培養(yǎng)板備用；HT-29細(xì)胞經(jīng)不同濃度桑寄生提取物（0、0.5、1、2g/ml）處理 24h 后，以 5×104個(gè)/200μl接種至Transwell上室，下室加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；棉簽擦掉基質(zhì)膠和上室底層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10min，磷酸緩沖鹽溶液洗3次，0.1%結(jié)晶紫染液染色20min；取小室并在用清水洗凈、晾干；在顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值；計(jì)算桑寄生對(duì)HT-29細(xì)胞的侵襲抑制率，抑制率=（1-藥物組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞懸液，接種于6孔板內(nèi)；將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；細(xì)胞長滿后，用微量槍頭劃線；并設(shè)置0、0.5、1、2g/ml桑寄生提取物藥物處理組，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)；在0、24h時(shí)點(diǎn)取樣，拍照。使用Image J軟件，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.7 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫印跡試驗(yàn)。HT-29細(xì)胞按照上述1.5藥物分組處理48h；棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液潤洗細(xì)胞3遍，加入RIPA裂解液，將細(xì)胞與細(xì)胞裂解液收集于1.5ml離心管中；12 000g離心10min，取上清液；按BCA蛋白定量試劑盒操作，檢測(cè)各樣品蛋白濃度，加入5×Loading制樣，煮沸后每組取蛋白20μg上樣 SDS-PAGE 膠，電泳（80V，60～90min），轉(zhuǎn)膜（120V，2h）。取出膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2h；TBST清洗3次，加入一抗 4℃孵育過夜；TBST清洗3次，室溫孵育二抗2h；TBST再次清洗，利用ECL顯影并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，不同劑量組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不同處理時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桑寄生提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖能力的影響 不同濃度（0、0.5、1、2、4、8g/ml）的桑寄生提取物處理細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞存活率隨著濃度的增加或時(shí)間的延長而降低，呈時(shí)間劑量依賴性（均P＜0.05），見圖1。桑寄生提取物在24、48、72h對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50依次為（6.1±0.2）、（3.5±0.3）、（2.2±0.2）g/ml。

2.2 桑寄生提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響 HT-29細(xì)胞經(jīng)1、2g/ml桑寄生提取物處理24h后，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（504±31）、（308±21）個(gè)，明顯低于空白對(duì)照組的（644±52）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而0.5g/ml桑寄生提取物處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（588±81）個(gè)，與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖2（插頁）。

圖1 不同濃度桑寄生提取物處理后HT-29細(xì)胞存活率

圖2 不同濃度桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響（a：Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果，×100；b：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.3 桑寄生提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞遷移能力的影響 經(jīng)1、2g/ml桑寄生提取物處理24h后，HT-29細(xì)胞遷移率分別為（66.7±6.4）%、（26.7±3.1）%，較空白對(duì)照組（100.0±15.0）%明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而0.5g/ml桑寄生提取物處理組細(xì)胞遷移率為（93.3±12.1）%，與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖 3（插頁）。

圖3 不同濃度桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞遷移能力的影響（a：劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，×4；b：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.4 桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)0.5、1、2g/ml桑寄生提取物處理48h后，HT-29細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白（MMP2、MMP9及VEGF）相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 4。

2.5 桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)0.5、1、2g/ml桑寄生提取物處理48h后，HT-29細(xì)胞PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而p-AKT、p-PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組（均 P＜0.05），見圖 5。

圖4 不同濃度桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞內(nèi)侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a：電泳圖；b：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）

圖5 不同濃度桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a：電泳圖；b：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）

3 討論

結(jié)腸癌患者預(yù)后及5年生存率，主要取決于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與否[6]。因此，針對(duì)抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的藥物研究具有重要意義。目前，桑寄生在臨床上已用于風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、頭暈?zāi)垦５燃膊〉闹委?。隨著對(duì)桑寄生有效成分的分析與研發(fā)，其在抗腫瘤方面的作用也被逐漸關(guān)注。如桑寄生總黃酮提取物能夠有效抑制人白血病細(xì)胞株HL-6的增殖[7]；桑寄生凝集素能夠有效抑制肝癌細(xì)胞株BEL-7402及胃癌細(xì)胞株MGC-823的增殖[8-9]。以上研究證明，桑寄生具有明確的抗腫瘤活性，但其作用機(jī)制并不清楚。為了進(jìn)一步探討桑寄生的抗腫瘤活性及其作一機(jī)制，本研究以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29為細(xì)胞模型，觀察不同濃度桑寄生提取物對(duì)HT-29細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，并分析可能的分子機(jī)制。結(jié)果顯示桑寄生提取物能抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)侵襲遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種信號(hào)通路及多種基因、細(xì)胞因子的調(diào)控[10-11]；因此，本研究從分子水平研究腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的機(jī)制。近年來研究證明，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，MMPs作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶的主要組成部分，對(duì)細(xì)胞基質(zhì)的重塑和降解起著重要作用[12]。腫瘤細(xì)胞從原位脫落，分泌MMP，其中MMP-2及MMP-9降解細(xì)胞周圍基質(zhì)，是腫瘤細(xì)胞侵入血液及淋巴循環(huán)并向遠(yuǎn)處遷移、從而形成新轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，MMP-2、MMP-9與結(jié)腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。在本研究中，空白對(duì)照組HT-29細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白呈高表達(dá)，而桑寄生提取物處理后的HT-29細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，這說明桑寄生提取物能抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，可能與抑制其MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；而VEGF途徑抑制劑已成為腫瘤治療的一種新治療手段[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑寄生提取物能降低HT-29細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)量，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。

PI3K/AKT信號(hào)通路是參與生命活動(dòng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[15]。研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥等特性密切相關(guān)[16]。PI3K通過與其上游分子的作用引起PI3K結(jié)構(gòu)變化，從而使AKT磷酸化而被激活，而活化的AKT通過調(diào)控其下游基因來參與腫瘤的增殖、侵襲等過程[15]。本研究結(jié)果顯示，桑寄生提取物處理后的HT-29細(xì)胞內(nèi)p-PI3K及p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，提示桑寄生提取物可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，桑寄生提取物能抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。