王毅超 謝姣貴 潘印 朱杰 楊合慧 朱韜 李招云

乳腺癌是全世界婦女最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率位居女性腫瘤的第2位[1]。目前我國女性乳腺癌發(fā)病率呈明顯的增長趨勢，預計至2021年，中國將有超過220萬例女性罹患乳腺癌[2]。目前關(guān)于乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚未完全闡明，且缺少可靠、準確的分子標志物用于早期診斷、動態(tài)監(jiān)測及預后分析；因此，探討乳腺癌進展的相關(guān)分子機制，尋找新的腫瘤標志物已經(jīng)成為乳腺癌研究的重點和難點。自噬是真核細胞生物中進化保守地對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程，是細胞內(nèi)一種通過溶酶體降解長壽命蛋白和受損細胞器的代謝途徑[3-4]。自噬可減少缺氧誘發(fā)的腫瘤壞死，抑制炎癥細胞浸潤，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是生物體內(nèi)普遍存在且進化上高度保守的一類非編碼小分子RNA，可通過調(diào)節(jié)靶基因，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控，細胞的增殖、分化、凋亡，個體發(fā)育及新陳代謝等生理活動[7]。研究顯示，miRNA-224-5p在腫瘤組織、外周血或細胞中的表達譜明顯不同于正常組織或細胞[8]。因此，本研究測定了乳腺癌患者血清中miRNA-224-5p的表達，并探討乳腺癌細胞中miRNA-224-5p對自噬活性的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 收集臺州市中心醫(yī)院2017年1月至2018年9月收治且行手術(shù)治療的40例乳腺癌女性患者（乳腺癌組）及同期性別、年齡相匹配的40例健康體檢者（健康對照組）的血液樣本。乳腺癌組患者年齡（49.5±10.6）歲；癌胚抗原水平（20.37±15.21）kU/L；CA153 水平為（33.18±10.56）μg/L；腫瘤位置：右乳 14 例，左乳 26例；手術(shù)類型：乳腺癌保乳術(shù)22例，改良乳腺癌根治術(shù)15例，腫塊切除術(shù)2例，單純?nèi)榉壳谐g(shù)1例；術(shù)后病理檢查：Luminal A型11例，Luminal B型19例，三陰性6 例，Her-2（3+）2 例，Her-2（2+）2 例；合并高血壓 5 例，糖尿病1例；均無飲酒史或吸煙史。健康對照組年齡（48.0±9.0）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準，兩組對象或家屬均簽署知情同意書。

1.2 材料 DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑盒購自美國 Invitrogen 公司，LC3 抗體（L7543，1∶2 000）購自美國 Sigma 公司，SQSTM1/p62（sc-28359，1∶500）購自美國Santa cruz公司；實驗所用質(zhì)粒購自蘇州吉馬基因公司。

1.3 血清miRNA-224-5p表達檢測 采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。使用Trizol試劑盒提取血清總RNA，采用RNA 6000 Nano LabChip Kit（安捷倫）和Bioanalyzer 2100測定RNA的純度和濃度，然后置于-80℃冰箱內(nèi)備用。使用Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司），嚴格按照說明書操作，配置為20μl的體系，將提取到的核糖核苷酸反轉(zhuǎn)錄為互補的第一鏈DNA。使用Super Real PreMIix Plus（北京天根生化科技有限公司）和ABI7300 Plus系統(tǒng)進行熱循環(huán)完成qRT-PCR。引物序列如下：miRNA-224-5p 正義為 5′-TGCCCTAGTGACTACAAAGTCG-3′，反義為 5′-CAGTGCAGGTCCGAGGTAT-3′；U6 正義為5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′，反義為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miRNA-224-5p mimics：5′-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3′，miRNA-224-5p inhibitor：5′-CUAAACGGAACCACUAGUGACUU －GA-3′。以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4 MDA-MB-231細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平檢測 采用免疫印跡試驗。（1）取乳腺癌細胞株MDA-MB-231，以8×104/孔濃度鋪12孔板，每孔加完全培養(yǎng)基1ml；當細胞融合度為60%左右時，換成無血清DMEM培養(yǎng)基，饑餓處理24h，使用Lipofectamine 2000及20nM miRNA-224-5p mimics（空白對照組）、miRNA-224-5p inhibitor（抑制物組）或空質(zhì)粒（空質(zhì)粒組）轉(zhuǎn)染MDAMB-231細胞。（2）轉(zhuǎn)染后48h收集細胞，對細胞總蛋白進行裂解和純化，取細胞裂解物進行自噬相關(guān)蛋白水平檢測，包括 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等。

1.5 miRNA-224-5p靶基因預測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org）、MiRDB（http://mirdb.org/miRDB/）在線預測 miRNA-224-5p靶基因。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miRNA-224-5p的靶基因是否為JAG1。將野生型的JAG1 3′-UTR片段或其突變體（沒有預測的miRNA-224-5p靶序列）分別構(gòu)建到pmirGLO質(zhì)粒上，將構(gòu)建的2種質(zhì)粒pmirGLO-JAG1野生型或突變型分別與miRNA-224-5p或陰性對照（空載體）共轉(zhuǎn)染293T細胞；轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞裂解液，采用雙熒光報告實驗系統(tǒng)檢測熒光活力，生物熒光檢測儀分析相對值，即相對熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-224-5p在乳腺癌血清中的表達 乳腺癌組血清miRNA-224-5p相對表達量為188.51±59.26，明顯高于健康對照組的41.63±14.29，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這初步表明miRNA-224-5p的表達上調(diào)與乳腺癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。

2.2 MDA-MB-231細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平 抑制miRNA-224-5p表達后，乳腺癌MDA-MB-231細胞SQSTM1蛋白表達水平較空質(zhì)粒組、空白對照組明顯降低，LC3Ⅰ蛋白表達水平較空白對照組明顯降低，LC3Ⅱ蛋白表達水平較空質(zhì)粒組、空白對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1和表1。這說明miRNA-224-5p具有抑制乳腺癌細胞自噬活性的作用。

2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶基因 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果顯示，miRNA-224-5p與攜帶JAG1野生型3′-UTR的載體共轉(zhuǎn)染后，與陰性對照組相比，相對熒光強度明顯降低（P＜0.05）；而缺失靶位點的突變型3′-UTR與miRNA-224-5p共轉(zhuǎn)染后，與陰性對照組相比，相對熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2和表2。這表明JAG1是miRNA-224-5p的靶基因。

圖1 3組MDA-MB-231細胞自噬相關(guān)蛋白表達的電泳圖

表1 3組MDA-MB-231細胞自噬相關(guān)蛋白水平

圖2 生物信息學預測miRNA-224-5p與JAG1結(jié)合的靶基因序列

表2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥南鄬晒鈴姸?/p>

3 討論

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤[9]，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率持續(xù)增高[10-11]。我國女性乳腺癌發(fā)病率也呈明顯的增長趨勢。因此，開發(fā)新型標志物以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤生長情況，實現(xiàn)對乳腺癌患者的早期診斷和個體化治療，是十分重要的工作。近年來，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[12-13]。miRNA在各體液中穩(wěn)定表達且具有腫瘤特異性、高度穩(wěn)定性，提示其作為疾病生物標志物的潛能[14]。miRNA-224-5p是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的一組miRNA前體，位于chrxq28，GABRE基因區(qū)，是一個已知的轉(zhuǎn)錄靜止區(qū)。已有研究提示，miRNA-224在許多腫瘤中表達異常，可調(diào)控與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的許多關(guān)鍵的生物學過程[15-16]。在非小細胞肺癌中，miRNA-224-5p通過靶向RASSF8促進癌細胞的增殖[17]；在骨肉瘤中，miRNA-224-5p參與了腫瘤的發(fā)生等[18]。目前關(guān)于miRNA-224-5p是否參與乳腺癌發(fā)生的研究較少。

本研究檢測了miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較健康對照組明顯升高。同時檢測了乳腺癌MDA-MB-231細胞中 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等3種自噬蛋白的表達，結(jié)果顯示抑制miRNA-224-5p表達后，SQSTM1、LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低，LC3Ⅱ表達明顯升高。這說明在乳腺癌患者中miRNA-224-5p的升高伴隨著自噬活性的減弱。此外還發(fā)現(xiàn)在過表達實驗中，miRNA-224-5p對自噬作用無明顯的影響，這可能是miRNA-224-5p在MDA-MB-231細胞中天然高表達的原因。然而在抑制實驗中，miRNA-224-5p水平直接影響細胞自噬水平，miRNA-224-5p可抑制細胞的自噬活性。故本研究初步表明，miRNA-224-5p可通過抑制乳腺癌自噬而參與乳腺癌的進展。

越來越多研究表明，miRNA可通過與腫瘤相關(guān)靶蛋白的miRNA結(jié)合后，作為促癌因子或抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生過程。為了闡明miRNA-224-5p抑制自噬的分子機制，本研究鑒定了可能由miRNA-224-5p調(diào)節(jié)自噬途徑中的潛在靶標。首先，通過生物信息學的網(wǎng)絡(luò)軟件TargetScan 7.2和MiRDB對miRNA-224-5p的靶基因進行了預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAG1有2個miRNA-224-5p潛在的結(jié)合位點，則推測JAG1為其靶基因。之后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸︻A測的靶基因作了進一步驗證。結(jié)果顯示miRNA-224-5p可互補結(jié)合JAG1的mRNA位點，即JAG1為miRNA-224-5p的靶基因。JAG1基因在染色體上定位于20p12，是5種Notch配體中的一種，屬于DSL蛋白家族，是單次跨膜蛋白，在細胞增殖分化過程中主要通過激活Notch信號通路發(fā)揮作用[19]。有研究表明，阻斷JAG1可以抑制乳腺癌細胞的繼續(xù)分裂，甚至引起細胞死亡，抑制Notch1表達后乳腺癌干細胞微球體的生成數(shù)量會下降，并且細胞的侵襲性、腫瘤的繁殖力和侵襲力均會減弱，這些預示著Notch1與乳腺癌細胞的惡性生物學行為密切相關(guān)[20-21]。因此，筆者推測miRNA-224-5p可能是靶向JAG1通過Notch信號通路發(fā)揮作用，從而參與乳腺癌的惡性行為。

綜上所述，miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中高表達，在MDA-MB-231細胞中miRNA-224-5p通過靶向JAG1抑制自噬活性。后續(xù)將從分子水平方面進一步驗證miRNA-224-5p與JAG1的直接相互作用，為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供更多的理論依據(jù)。