姚蘊恒，白龍律，武倫鵬，吳信子，何 苗，李東浩，任秀麗

(1.延邊朝鮮族自治州檢驗檢測中心，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué) 長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室,吉林 延吉 133002；3.延邊大學(xué) 工學(xué)院,吉林 延吉 133002)

人參，多年生草本植物，又稱“百草之王”，東北三寶之一，其藥用價值極高，具有抗腫瘤、抗高血壓、抗衰老、降血脂[1]等功效，作為一種膳食補充劑已被人類食用上千年。為了使人參在種植和儲存過程中免受病、蟲害侵襲，農(nóng)藥的使用必不可少[2]，因不規(guī)范使用造成人參中農(nóng)藥殘留超標(biāo)時有發(fā)生，嚴(yán)重威脅消費者身體健康[3]。我國已有標(biāo)準(zhǔn)[4-5]規(guī)定了人參中農(nóng)藥殘留最大限量(MRL)，但僅涉及20多種農(nóng)藥，且以有機(jī)氯、有機(jī)磷類農(nóng)藥為主，因此，建立一種靈敏度高、高選擇性的人參中農(nóng)藥多殘留分析方法具有重要意義。

目前，我國在用農(nóng)藥有800多種，農(nóng)藥的多樣性與復(fù)雜性使其樣品前處理方法成為分析關(guān)鍵[6-7]，已有農(nóng)藥殘留檢測的樣品前處理方法主要為固相萃取法(SPE)[9]、液液萃取法(LLE)[10]、基質(zhì)固相分散萃取法(MSPD)[11]、盧克(Luke)法[12]等，但這些方法存在檢測種類單一、耗時、耗力且耗溶劑等局限?；诖?，Anastassiades等[13],于2003年發(fā)明了一種集萃取和凈化為一體的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)前處理方法，樣品經(jīng)乙腈提取分離后加入NaCl和MgSO4等鹽類除水，再加入PSA、C18等吸附劑除雜，該法又稱為Original QuEChERS方法。隨后，研究人員針對一些酸堿敏感的農(nóng)藥對該法進(jìn)行了修改，其中一種采用醋酸鈉緩沖鹽提取體系的Acetate QuEChERS方法，于2007年成為美國分析化學(xué)家協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)方法(AOAC 2007.01)；另一種采用檸檬酸緩沖鹽提取體系的Citrate QuEChERS方法，于2008年成為歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)方法(EN 15662)。上述3種QuEChERS方法均被廣泛應(yīng)用于蔬菜[14]、水果[15]、谷類[16]等食品中的農(nóng)藥多殘留檢測，但對于基質(zhì)復(fù)雜的人參樣品的檢測鮮見報道[3,8,17-19]，因此，建立一種快速分析人參中農(nóng)藥多殘留的分析方法具有重要意義。

已有研究表明，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)[20-22]比氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)更適合農(nóng)殘檢測，這是因為GC-MS/MS采用二級MS離子定性，既可排除假陽性，又可提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確性?；诖耍疚囊罁?jù)GB/T 19506-2009《地理標(biāo)志產(chǎn)品吉林長白山人參》及《中華人民共和國藥典》2015版中涉及的農(nóng)藥目錄，結(jié)合目前實際用于人參種植中的農(nóng)藥種類，選擇有機(jī)氯、有機(jī)磷、菊酯類等41種代表性農(nóng)藥作為目標(biāo)分析化合物，以QuEChERS方法為基礎(chǔ)，建立了一種QuEChERS/GC-MS/MS檢測人參中農(nóng)藥多殘留的分析方法，并對實際樣品進(jìn)行了分析檢測，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TRACE 1300氣相色譜-TSQ 8000 Evo三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，TD6M低速離心機(jī)(鹽城市凱特實驗儀器有限公司)，EVA 50A氮吹儀(北京普立泰科儀器有限公司)，QL-901渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

41種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液(100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢驗所)；內(nèi)標(biāo)：磷酸三苯酯(TPP，100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；乙腈、乙酸乙酯、冰醋酸(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；無水硫酸鎂(MgSO4)、無水氯化鈉(NaCl)、無水醋酸鈉(NaOAc)、N-丙基乙二胺(PSA)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)、檸檬酸氫二鈉(Na2C6H6O7)(深圳逗點生物技術(shù)有限公司)；實驗用水為色譜純，購于德國CNW Technologies 公司。人參樣品均購于本地商場和超市。

1.2 樣品前處理

將人參樣品60 ℃干燥后，粉碎至粉末狀，均質(zhì)，備用。

1.2.1 Original QuEChERS準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，搖勻后浸泡15 min，再加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，最后加入4 g 無水MgSO4和1 g NaCl，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心10 min。精密移取6 mL有機(jī)層溶液至15 mL聚丙烯離心管中，加入150 mg PSA和900 mg 無水MgSO4，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心5 min。

1.2.2 Acetate QuEChERS準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，搖勻后浸泡15 min，再加入10 mL含1%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸的乙腈，渦旋振蕩1 min，最后加入6 g 無水MgSO4和1.5 g NaOAc，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心10 min。精密移取6 mL有機(jī)層溶液至15 mL聚丙烯離心管中，加入300 mg PSA和900 mg 無水MgSO4，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心5 min。

1.2.3 Citrate QuEChERS準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，搖勻后浸泡15 min，最后加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，最后加入4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心10 min。精密移取6 mL有機(jī)層溶液至15 mL聚丙烯離心管中，加入150 mg PSA和900 mg 無水MgSO4，渦旋振蕩1 min，于 3 500 r/min離心5 min。

上述3種QuEChERS程序完成后，精密移取2 mL上清液于10 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，殘渣加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液和1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待GC-MS/MS檢測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)(TPP)溶液：取1 mL 100 μg/mL TPP標(biāo)準(zhǔn)溶液于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，得5 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃冰箱中保存，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取1 mL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)于200 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋定容至刻度，得0.5 μg/mL 41種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃冰箱中保存，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取一定體積的0.5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯依次稀釋制得質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照“1.2”方法前處理不含目標(biāo)農(nóng)藥的“空白”人參樣品，然后精密移取2 mL上清液至10 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，再分別加入0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，配成對應(yīng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm微孔濾膜，待測，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)。進(jìn)樣口溫度280 ℃。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min升至120 ℃；再以5 ℃/min升至240 ℃；最后以12 ℃/min升至300 ℃，保持6 min；總運行時間為38 min。載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)；恒流模式，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：接口溫度為280 ℃，電離模式：電子轟擊電離(EI)；轟擊能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃;碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999%);溶劑延遲：5 min;選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式;Trace Finder工作站軟件用于儀器控制與數(shù)據(jù)處理。41種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)的保留時間、離子對信息及碰撞電壓見表1。

表1 41種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)化合物的化學(xué)式、保留時間、離子對及碰撞電壓Table 1 Chemical formulas,retention times,ion pairs and collision energies of the 41 pesticides and internal standard

(續(xù)表1)

*quantitative ion pair(定量離子對)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于41種農(nóng)藥的分子極性相對較弱，因此選擇極性較小的TG-5MS石英毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分析，并通過優(yōu)化柱箱的升溫程序，使各農(nóng)藥能夠有效分離。實驗選擇SRM模式下的兩對離子對進(jìn)行分析，一對用于定量分析，一對用于定性分析，并對目標(biāo)農(nóng)藥的母離子、子離子、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,確保每個目標(biāo)農(nóng)藥色譜峰的采集點數(shù)量在15個左右，以滿足響應(yīng)值的要求。優(yōu)化后41種農(nóng)藥的色譜-質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 空白人參樣品基質(zhì)的GC-MS/MS全掃描色譜圖Fig.1 Full scan chromatograms of ginseng blank extract analysed by GC-MS/MS

2.2 前處理方法優(yōu)化

為獲得最佳的前處理方法，實驗采用“空白”人參樣品加標(biāo)考察了Original、Acetate、Citrate 3種QuEChERS處理方法對人參中41種農(nóng)藥的提取效率和凈化效果。結(jié)果顯示，3種前處理方法的農(nóng)藥回收率差異顯著，Original方法有97.6%的農(nóng)藥回收率為80%～120%，Acetate方法中農(nóng)藥的回收率大多集中在40%～60%之間，而Citrate方法中僅9.5%的農(nóng)藥回收率為80%～120%。為進(jìn)一步了解差異性的原因，對經(jīng)3種QuEChERS方法處理后的“空白”人參樣品進(jìn)行全掃描(Full scan)，結(jié)果見圖1。由圖可見，經(jīng)Acetate方法處理的萃取液中，共萃取基質(zhì)含量最多，其次為Citrate方法，而Original方法的共萃取基質(zhì)含量最少。這是因為，Acetate和Citrate方法分別采用醋酸鈉緩沖提取體系(pH=4.8)和檸檬酸鈉緩沖提取體系(pH=5.1),兩者的提取體系均呈弱酸性，且Acetate提取體系的pH值更低，使人參中部分基質(zhì)化合物更易被共提取出來，從而增加了其共萃取基質(zhì)含量，導(dǎo)致目標(biāo)農(nóng)藥的回收率下降。因此，本研究選擇Original QuEChERS前處理方法進(jìn)行人參樣品中41種農(nóng)藥的提取和凈化。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)是指樣品中目標(biāo)分析物以外的組分對目標(biāo)分析物分析過程的離子化產(chǎn)生的抑制與增強作用[23-24]，基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配工作曲線的斜率/純?nèi)軇┲泄ぷ髑€的斜率，其比值越接近1，則表明基質(zhì)效應(yīng)越小，反之則表明基質(zhì)效應(yīng)越大。本研究經(jīng)Original QuEChERS方法前處理后，仍有部分共萃取基質(zhì)被提取，無法完全消除基質(zhì)效應(yīng)，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，且以β-六六六(1.920)、腐霉利(1.679)、烯唑醇(1.753)、氟氰戊菊酯-1(2.322)、氟氰戊菊酯-2(2.427)的基質(zhì)效應(yīng)最為明顯。因此，為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量下限取1.0 g“空白”人參樣品，經(jīng)“1.2”方法處理后，取2 mL上清液于10 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，再分別加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，配成10、25、50、100、200 μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm微孔濾膜，在優(yōu)化條件下測定，并以各化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，41種農(nóng)藥在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。分別以信噪比(S/N)為3和10時計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得41種農(nóng)藥的LOD和LOQ分別為2.0～6.0 μg/kg和5.0～20.0 μg/kg，完全滿足人參中農(nóng)藥殘留的測定要求。

表2 41種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r),recoveries,RSDs,LODs and LOQs of 41 pesticides

(續(xù)表2)

*the number and name of pesticide are identical to those in Table 1;-:no data

2.4.2 回收率與精密度取“空白”人參基質(zhì)進(jìn)行41種農(nóng)藥化合物的加標(biāo)(10、20、100、200 μg/kg)回收實驗，每個濃度平行實驗6次，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，在4個加標(biāo)水平下41種農(nóng)藥的回收率為86.7%～115%，RSD均小于15%(表2)。表明本方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可用于人參中41種農(nóng)藥的同時測定。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法在優(yōu)化條件下對本地超市和市場采集的50份人參樣品進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，2個樣品檢出甲基對硫磷，含量分別為42.9、73.1 μg/kg;1個樣品檢出氟蟲腈和毒死蜱，含量分別為36.5 μg/kg和32.9 μg/kg;1個樣品檢出腐霉利，含量為36.7 μg/kg;1個樣品中檢出除草醚，含量為30.3 μg/kg;1個樣品檢出異丙甲草胺，含量為130.0 μg/kg，1個樣品檢出甲基異柳磷，含量為22.1 μg/kg。其余樣品中41種農(nóng)藥均未檢出。圖2為一個陽性人參樣品中檢出異丙甲草胺農(nóng)藥殘留的色譜圖。

圖2 人參樣品中異丙甲草胺的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of metolachlor in ginseng sample

3 結(jié) 論

本文建立了同時檢測人參中41種農(nóng)藥殘留的QuEChERS/GC-MS/MS分析方法，并對3種QuEChERS前處理方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，采用Original QuEChERS前處理方法時能夠有效去除基質(zhì)干擾，且97.6%的目標(biāo)農(nóng)藥回收率在80%～120%之間，能夠滿足國內(nèi)對農(nóng)藥殘留檢測中精密度和準(zhǔn)確度的要求。該方法操作簡單、高效、靈敏可靠，為人參中多農(nóng)藥殘留的風(fēng)險評估、檢測等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。