朱 俐，趙 瑜，姚尚辰，許明哲，尹利輝，胡昌勤

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

藥物中的元素雜質(zhì)是藥品質(zhì)量控制和保證(QC/QA)的重要組成部分，也是一個(gè)關(guān)注熱點(diǎn)[1-6]，根據(jù)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)和藥典規(guī)定，測(cè)定原料藥、輔料、藥物制劑及生產(chǎn)過(guò)程中每個(gè)階段的元素雜質(zhì)并將其控制在可接受的限度范圍內(nèi)是非常重要的[7]。元素雜質(zhì)的測(cè)定不僅可以快速明確地表征藥物生產(chǎn)環(huán)節(jié)的污染情況，而且可以規(guī)范藥品質(zhì)量，保證藥品安全[8]。藥物活性成分(API)、原輔料及中間體都可能含有金屬、非金屬或類金屬元素。藥物中的元素雜質(zhì)可能是非故意引入，比如As、Cd、Hg、Ni、Pb元素可通過(guò)原料(水、試劑和合成的API)或輔料(穩(wěn)定劑、填充劑、粘合劑、顏料等)引入[9-15]；還有可能是非故意性帶入，如Cr、Cu、Mo、Ni、V，可能來(lái)源于藥物與反應(yīng)容器或制藥設(shè)備(混合罐、過(guò)濾器和灌裝線等)的表面相互作用，此外包裝和儲(chǔ)存過(guò)程中元素雜質(zhì)的浸出也可能無(wú)意引入元素雜質(zhì)[16]。在API合成中加入重金屬催化劑也可導(dǎo)致藥物制劑中存在痕量或超痕量的元素雜質(zhì)，如Ir，Os、Pd、Pt、Rh和Ru元素[17]。

藥物制劑中的元素雜質(zhì)由于存在潛在毒性和可能引起的健康風(fēng)險(xiǎn)而備受企業(yè)和消費(fèi)者的關(guān)注[18]。藥物中的元素雜質(zhì)對(duì)患者沒(méi)有任何治療作用，并可以催化API降解，從而縮短藥物的保質(zhì)期,產(chǎn)生副作用或不良反應(yīng)，損害人體健康。因此，藥品生產(chǎn)過(guò)程中使用的各種原輔料、水以及反應(yīng)中間體都需要監(jiān)控元素雜質(zhì)，這樣才能確保藥品元素雜質(zhì)水平符合規(guī)定，保證藥品的安全性和有效性[19]。美國(guó)藥典(USP)和國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)(International Conference on Harmonization,ICH)對(duì)元素雜質(zhì)都有了新的分析和控制策略[20]。與早期的重金屬分析方法相比，新的分析策略不僅擴(kuò)大了檢測(cè)元素范圍而且降低了檢出限。目前我國(guó)藥品元素雜質(zhì)檢測(cè)方法依然采用具有百年歷史的比色法，其原理為金屬離子與硫化物離子反應(yīng)顯色，再與標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液(質(zhì)量濃度為1.0×10-3mg/L)進(jìn)行目視比色[21]。該方法缺乏特異性、靈敏性和準(zhǔn)確性，存在主觀目測(cè)顏色誤差；并且只能得到樣品中元素雜質(zhì)的總量值，不能對(duì)單個(gè)元素雜質(zhì)進(jìn)行定量分析。ICH Q3D元素雜質(zhì)指南提出了元素雜質(zhì)的分類和控制要求。隨著中國(guó)加入ICH，意味著中國(guó)也要遵循ICH指南和標(biāo)準(zhǔn)。ICH Q3D提出對(duì)藥物中的元素雜質(zhì)需進(jìn)行定性和定量分析評(píng)估，并限制最低元素雜質(zhì)含量。元素雜質(zhì)已越來(lái)越受到制藥企業(yè)和藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的關(guān)注，為了適應(yīng)新的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)代化的儀器分析技術(shù)已經(jīng)逐步代替老舊的方法。本文總結(jié)了近年來(lái)藥物中元素雜質(zhì)的分析方法，以期為藥品中元素雜質(zhì)的質(zhì)量分析提供新的思路。

1 藥品質(zhì)量控制與不同分析技術(shù)的應(yīng)用

藥品質(zhì)量控制指整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量評(píng)估，包括原料、API和藥品、包裝材料等。藥物不同的物理化學(xué)性質(zhì)、基質(zhì)的多樣性及新法規(guī)的限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)分析方法提出了更高的要求，即雜質(zhì)分析需達(dá)到μg/g和ng/g水平，對(duì)應(yīng)的理想分析方法的檢出限應(yīng)低于ng/g。如此低的檢出限不僅要有更靈敏的分析儀器，而且對(duì)儀器選擇性也提出了更高的要求，因?yàn)樵谳^低的濃度范圍內(nèi)可能存在很多雜質(zhì)。各國(guó)藥典均有收載的比色法屬于定性分析，已經(jīng)不能滿足目前元素雜質(zhì)分析的要求，必然會(huì)被高靈敏度的分析方法所替代，如電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)，不僅分析速度快、檢出限低，且可以同時(shí)分析多種元素，工作曲線范圍寬[22-24]。目前原子吸收光譜法(AAS)、X射線熒光光譜法(XRF)、儀器中子活化分析(INAA)、ICP-OES和ICP-MS等方法已經(jīng)用于藥物中金屬雜質(zhì)的分析。ICP-OES和ICP-MS是ICH Q3D推薦的元素雜質(zhì)檢測(cè)方法?；诘入x子的分析技術(shù)，如微波等離子體發(fā)射光譜(MP-OES)、ICP-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ICP-TOF MS)、高分辨等離子體質(zhì)譜(HR-ICP-MS)和同步ICP-MS具有更強(qiáng)大的功能，也已用于藥物的元素分析[25-28]。還有更新的技術(shù)，如激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)和激光燒蝕ICP-MS(LA-ICP-MS)也開(kāi)始在制藥行業(yè)的元素分析中得到更廣泛的應(yīng)用。

1.1 用于快速篩查的便攜式分析儀器

在藥品研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制及銷售的每個(gè)階段，都需要進(jìn)行快速元素篩查?？焖俸Y查方法最好不需要樣品制備或者只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的樣品制備，分析速度要快，且檢出限能達(dá)到藥品標(biāo)準(zhǔn)的要求，最重要的是儀器便攜。早期由于缺少便攜式分析儀器，快速篩查方法發(fā)展緩慢，但近幾年來(lái)已經(jīng)研制出很多便攜式、手持式光譜儀，采用此類光譜儀進(jìn)行藥品快速篩查可取得較好的效果。目前，用于藥品生產(chǎn)過(guò)程和終端產(chǎn)品定性篩查的有4類便攜式儀器：便攜式X熒光光譜儀(XRF)、離子遷移譜(IMS)、拉曼光譜和近紅外光譜(NIR)，并分別用于檢測(cè)重金屬、保健食品中的化學(xué)藥品和藥物成分中的有機(jī)污染物。NIR光譜還可以用來(lái)定性和定量鑒別假藥和非法仿制藥[29]，LIBS也可以替代便攜式XRF用于重金屬快速篩查[30-31]。雖然便攜式XRF的檢測(cè)限較高且無(wú)法檢測(cè)原子序數(shù)小于12的元素，但仍廣泛作為快速篩查技術(shù)用于制藥行業(yè)。Arzhantsev等[32]建立了基于連續(xù)小波變換濾波器的XRF分析新方法，并將該方法用于手持式XRF光譜儀測(cè)定藥物材料中的有毒金屬，無(wú)需在測(cè)量前測(cè)量校準(zhǔn)樣品。尹利輝等[33]采用便攜式XRF建立了膠囊中鉻的快速篩查方法，不僅通量高而且可以實(shí)時(shí)檢測(cè)，適用于藥品生產(chǎn)過(guò)程控制和上市藥品的質(zhì)量監(jiān)督。

1.2 常規(guī)測(cè)試方法

目前中國(guó)藥典仍采用傳統(tǒng)的比色法進(jìn)行重金屬(Ag、As、Bi、Cd、Cu、Hg、Mo、Pb、Sb和Sn)檢測(cè)，該方法通過(guò)有色重金屬硫化物沉淀來(lái)確定金屬雜質(zhì)的含量：首先將藥品在500～600 ℃(800 ℃，歐洲藥典)熾灼使之灰化，調(diào)節(jié)pH值后加入硫代乙酰胺顯色，最后通過(guò)目視與經(jīng)同樣方法處理的0.001%(10 μg/ mL)鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顏色比較。盡管該方法在制藥工業(yè)中被廣泛接受和使用，但由于基于硫化物沉淀顯色的方法是非特異性的，其靈敏度低，耗時(shí)耗力，且回收率很低或根本沒(méi)有回收率[9]，這類傳統(tǒng)過(guò)時(shí)的方法必將被先進(jìn)的儀器分析方法所取代。

1.3 紫外光譜法

紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)分光光度法由于相對(duì)經(jīng)濟(jì)、快速和簡(jiǎn)便而被廣泛采用。對(duì)于固定光程，UV-Vis分光光度法可用于測(cè)定本身對(duì)紫外可見(jiàn)光有吸收的金屬元素。采用UV-Vis測(cè)定時(shí)，可用配體選擇性地結(jié)合金屬離子(如鐵(Ⅱ)和銅(Ⅱ))形成有更高摩爾吸光系數(shù)的有色絡(luò)合物，從而提高在不同藥物中的檢測(cè)靈敏度[34]。Janwadkar等[35]以2′，4′-二羥基苯乙酮縮氨基脲作為萃取劑，用分光光度法測(cè)定了藥物樣品中的Ce(Ⅵ)，該方法不僅可以測(cè)定各種合金、礦石，還可以測(cè)定藥物中的特定有機(jī)金屬化合物。Basotra等[36]開(kāi)發(fā)出一種新型分光光度法，該方法將藥物與鄰苯二胺絡(luò)合，通過(guò)檢測(cè)706 nm處綠色復(fù)合物的吸光度，用于鹽酸順鉑片的精確測(cè)定，方法準(zhǔn)確性可達(dá)99.98%。

表1 市售阿司匹林制劑中有毒重金屬雜質(zhì)含量的AAS測(cè)定結(jié)果[45]Table 1 Determination results of toxic heavy metal impurities in commercially available aspirin preparations by AAS[45]

1.4 原子吸收光譜法(AAS)

常用的火焰原子吸收光譜法(F-AAS)可用于測(cè)定不同材料包括藥品中μg/mL及以下含量的金屬元素[37-38]。石墨爐原子吸收(GF-AAS)由于樣品全部參與原子化，且避免了原子濃度在火焰氣體中的稀釋，分析靈敏度得到了顯著提高，適用于分析超痕量(ng/mL)的金屬元素并能用于少量樣品的分析和固體樣品的直接分析。汞可以采用冷原子吸收法檢測(cè)，而一些類似As、Sb的“揮發(fā)性”元素可以通過(guò)氫化物法進(jìn)行檢測(cè)[39]。冷原子吸收尤其適用于檢測(cè)痕量汞，通過(guò)測(cè)定254 nm處的吸收檢測(cè)藥物中的汞，檢出限可達(dá)9 ng/mL[40]，冷原子吸收的主要優(yōu)點(diǎn)是可以將汞從基質(zhì)中完全分離[41]。F-AAS和GF-AAS均可在藥物質(zhì)量控制中可靠地檢測(cè)金屬雜質(zhì)。Gomez等[42]通過(guò)AAS監(jiān)測(cè)了貫葉連翹藥物衍生物中Ca、Cu、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni和Zn的含量，張珉娜等[43]用火焰原子吸收光譜監(jiān)測(cè)翁瀝通膠囊里的銅用以評(píng)估藥品的質(zhì)量，王梅等[44]采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜測(cè)定了布洛芬原料藥中的微量金屬雜質(zhì)。表1列出了由AAS確定的各種市售阿司匹林制劑中有毒重金屬雜質(zhì)的含量(μg/g)[45]。AAS技術(shù)也有其局限性，比如，F(xiàn)-AAS的靈敏度較低，對(duì)于痕量、超痕量分析需進(jìn)行富集和分離；不能進(jìn)行多元素同時(shí)分析；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍窄等，但該方法由于專屬性好等優(yōu)點(diǎn)仍然應(yīng)用廣泛。

1.5 X射線熒光光譜法(XRF)

XRF由于樣品制備簡(jiǎn)單、可多元素同時(shí)分析而逐漸受到廣泛關(guān)注。XRF是利用初級(jí)X射線光子或其他微觀離子激發(fā)待測(cè)物質(zhì)中的原子，使之產(chǎn)生熒光(次級(jí)X射線)而進(jìn)行物質(zhì)成分分析和化學(xué)態(tài)研究的方法。樣品可以是固態(tài)、粉末和液態(tài)。XRF是非接觸分析，因此不會(huì)產(chǎn)生記憶效應(yīng)，且XRF檢測(cè)無(wú)需破壞樣品，因此樣品可以回收再利用。目前，波長(zhǎng)色散型X射線熒光光譜儀和能量色散型X射線熒光光譜儀均已被應(yīng)用于藥物API中Zn、Fe和Ni的測(cè)定[46]。Marguí等[47]采用波長(zhǎng)色散型X熒光光譜儀檢測(cè)藥物中的金屬雜質(zhì)(Fe、Zn、Cr和Ni)，并根據(jù)歐洲藥品評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)(EMEA)和ICH的規(guī)范對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。Kikongia等[48]采用波長(zhǎng)色散型XRF，通過(guò)擬合回歸的方法測(cè)定了藥物原料中的痕量重金屬Ni、Cr、Pb ，并取得了良好的結(jié)果。Arnet等[49]采用XRF測(cè)定了8種頭孢曲松仿制藥中的元素雜質(zhì)，在8種仿制藥中都檢出了Br和Zn，而在原研藥中未檢出元素雜質(zhì)。Linder等[50]使用二芐基二硫代氨基甲酸酯(Dibenzyldithiocarbaminate)作為共沉淀劑，用XRF測(cè)定了藥物中常見(jiàn)的12種金屬元素。全反射XRF也可以測(cè)定藥物中的痕量元素，Wagner等[51]采用全反射XRF研究了卵磷脂、胰島素和不同來(lái)源的普魯卡因和色氨酸中的金屬元素，并根據(jù)元素濃度的微小差異區(qū)分了不同批次、不同生產(chǎn)工藝或純化過(guò)程的藥物。相較于其他傳統(tǒng)的分析儀器，XRF具有較高的檢出限，因此在藥廠中應(yīng)用較少，也不適用于對(duì)藥物中元素雜質(zhì)的準(zhǔn)確定量。

1.6 儀器中子活化分析法(Instrumental neutron activation analysis，INAA)

INAA是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的分析技術(shù)，可用于測(cè)定各種材料中的元素豐度。該方法通過(guò)鑒別和測(cè)試樣品因輻照感生的放射性核素的特征輻射，進(jìn)行元素和核素分析，以γ射線分光儀測(cè)定光譜，根據(jù)波峰分析確定樣品成分后，基于輻射能的強(qiáng)弱進(jìn)行定量分析。最近50年，該技術(shù)在環(huán)境、地質(zhì)、植物、食品和藥物的微量元素分析工作中得到了廣泛應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)有：(1)樣品無(wú)需處理可直接測(cè)試；(2)所需樣品量非常少，通常只需幾毫克；(3)很多元素的檢出限在ng/g范圍內(nèi)；(4)可同時(shí)檢測(cè)超過(guò)40種元素。由于上述優(yōu)點(diǎn)，在電ICP-MS出現(xiàn)之前，INAA深受分析工作者的喜愛(ài)。Chen等[52]早在1993年就用INAA測(cè)定了天然藥物樣品中的14種微量元素(K、Sc、Cr、Fe、Co、Zn、Br、Rb、Cs、La、Sm、Eu、Au和Th)。Choudhury等[53]采用中子活化分析技術(shù)分析了中草藥中的31種元素，Kamath等[54]使用ICP-AES和INAA技術(shù)測(cè)定了一些傳統(tǒng)印度藥物中的汞。放射性藥物在注冊(cè)前需對(duì)有毒重金屬元素進(jìn)行定量，Hernndez[55]使用INAA精確地測(cè)定了3種放射性藥物(六甲基丙叉二胺肟(HMPAO)，二巰基丁二酸(DMSA)和二乙三胺五乙酸(DTPA))中的40種微量和痕量元素。盡管INAA具有很多優(yōu)點(diǎn)，但因?yàn)椴捎迷摲y(cè)定時(shí)需要反應(yīng)堆，存在放射性，且需要對(duì)不同半衰期的核素進(jìn)行分次測(cè)量，使得大部分元素的分析周期較長(zhǎng)，從而限制了其廣泛使用。

1.7 電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)

ICP-OES是利用高頻電感耦合產(chǎn)生等離子體放電的光源進(jìn)行原子發(fā)射光譜分析的方法,通過(guò)將樣品的發(fā)射光譜強(qiáng)度與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度進(jìn)行比較，獲得未知樣品中的相應(yīng)元素濃度[56-57]。該法最大的優(yōu)點(diǎn)是可在很寬的線性范圍內(nèi)同時(shí)高靈敏地檢測(cè)約60種元素[58-59]并且具有較寬的動(dòng)態(tài)線性范圍。美國(guó)藥典新通則USP<233>推薦ICP-OES和ICP-MS為元素雜質(zhì)的檢測(cè)方法。Stoving等[20]應(yīng)用ICP-OES法測(cè)定了藥片中As、Cd、Cu、Cr、Fe、Hg、Ir、Mn、Mo、Ni、Os、Pb、Pd、Pt、Rh、Ru、V和Zn的含量。楊永健等[60]以格列齊特為研究對(duì)象，采用分組的方式，克服了元素之間的光譜干擾,建立了化學(xué)原料藥中19種金屬雜質(zhì)的ICP-OES檢測(cè)方法。采用ICP-OES分析元素含量時(shí)，由于分析譜線的重疊，在測(cè)量過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生光譜干擾而影響檢測(cè)結(jié)果，為了排除干擾，需更換無(wú)干擾的分析譜線。然而，有時(shí)不存在完全沒(méi)有潛在光譜干擾的波長(zhǎng)，如Ir、Os、Pb、Pt和Rh。此外，記憶效應(yīng)可能導(dǎo)致誤差很大，如 Os易被氧化成OsO4并在樣品引入系統(tǒng)中積累。類似有記憶效應(yīng)的另一個(gè)元素是Hg，因此要注意控制進(jìn)樣量，避免引入高濃度的汞而導(dǎo)致結(jié)果誤差。最后，由于制備的樣品溶液中易于電離的元素(EIE)的含量高，如Ca、K、Mg和Na，可能導(dǎo)致出現(xiàn)化學(xué)干擾，特別是對(duì)于含有不同礦物賦形劑的藥物或腸胃外溶液[61]。

1.8 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)

相較于ICP-OES，ICP-MS更適用于痕量和超痕量元素分析，檢出限可達(dá)10-12g/mL。ICP-MS線性范圍寬，譜線簡(jiǎn)單，分析速度快速，靈敏度高，可以定量和半定量，幾乎可以分析所有元素[62]，并且該方法所需的樣品量非常少，樣品溶液濃度較低，從而最大程度地減少了可能出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)。自1980年首次將ICP離子源與四極桿質(zhì)譜連接之后，其商用儀器也于1983年問(wèn)世。應(yīng)用四極桿質(zhì)譜進(jìn)行元素分析會(huì)相應(yīng)降低分析能力，主要是由于藥品中的基質(zhì)元素會(huì)產(chǎn)生多元素干擾，如樣品中存在C、Cl、S和P元素時(shí)會(huì)導(dǎo)致等離子體中形成多原子離子，干擾As、Cr、Cu元素的測(cè)定[63]。隨著ICP-MS技術(shù)的快速發(fā)展，碰撞/反應(yīng)池和離子阱分析器技術(shù)可完全消除或減少多原子光譜干擾。因此，ICP-MS已經(jīng)成為元素痕量分析的重要手段。Wang等[9]采用藥典中規(guī)定的重金屬比色法和ICP-MS分析了藥物中的痕量元素，并指出了重金屬比色法的局限性，建議采用ICP-MS替代過(guò)時(shí)的“重金屬限度檢查”。Lásztity等[7]采用ICP-MS測(cè)定馬來(lái)酸依那普利中的Pd、亞葉酸鈣中的Pt和左旋多巴中的Rh，檢測(cè)限分別為15、2.8、2.5 ng/g。Murty等[5]通過(guò)ICP-MS測(cè)定了雙環(huán)胺、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和呋喃唑酮類藥物中的重金屬含量，通過(guò)選擇合適的同位素，分析藥物中的Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Cd、Hg、Pb含量，發(fā)現(xiàn)Cr、Fe、Ti和Cu分別在雙環(huán)胺、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和呋喃唑酮中含量最高，4種藥物中均不含Ni和Hg，而乙胺丁醇和吡嗪酰胺中存在痕量的Cd。Pinheiro等[64]采用ICP-MS測(cè)定了9種藥品中ICH Q3D規(guī)定的23種金屬元素(除Os外)，回收率為72%～128%，9種藥品的元素雜質(zhì)含量均符合USP<232>的規(guī)定。許雯雯等[65]采用ICP-MS法測(cè)定了鹽酸安舒法辛緩釋片中7個(gè)元素雜質(zhì)的含量，其相關(guān)系數(shù)均大于0.99，加標(biāo)回收率為92.2%～104%，重復(fù)性RSD≤1.2%(n=6)，精密度RSD≤3.0%，滿足USP<233>方法學(xué)驗(yàn)證的要求。樣品的檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)小于ICH Q3D中各元素雜質(zhì)的每日允許暴露量(PDE)。張磊等[66]用ICP-MS測(cè)定了氟哌酸藥物中的21種元素雜質(zhì)，汞在0～10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其他20種目標(biāo)元素在0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r均大于0.999 0，平均回收率為80%～120%。Lewen等[67]建立了藥物中金屬元素的ICP-MS快速篩查方法，可對(duì)藥物中的As、Se、Cd、In、Sn、Sb、Pb、Bi、Ag、Pd、Pt、Hg、Mo和Ru進(jìn)行篩查，回收率在89%～102%之間。Balaram[68]采用硝酸消解樣品，通過(guò)ICP-MS測(cè)定了4種市售藥物中34種元素雜質(zhì)的濃度，結(jié)果表明ICP-MS可作為藥物中元素雜質(zhì)的監(jiān)測(cè)方法。

2 樣品制備

根據(jù)樣品類型，USP<233>提出的藥物元素分析可以采用ICP-OES和ICP-MS兩種方法[69]進(jìn)行，這兩種方法不僅可以提高檢測(cè)能力和靈敏度，而且減少了樣品制備步驟。由于ICP-OES和ICP-MS需要將樣品消解，因此在元素雜質(zhì)分析之前的樣品制備是關(guān)鍵步驟。通常情況下，元素雜質(zhì)在復(fù)雜的基質(zhì)中以低濃度存在，因此在樣品制備中應(yīng)防止元素雜質(zhì)的損失及二次污染。

USP<233>規(guī)定了樣品制備的4種主要優(yōu)選方法(圖1)，這些樣品制備方法適用于ICP-OES和ICP-MS，可降低樣品污染或目標(biāo)元素?fù)p失的風(fēng)險(xiǎn)。但是，由于藥物樣品的多樣性，USP<233>未給出詳細(xì)的步驟，因此樣品制備具體方法的選擇取決于樣品的性質(zhì)[69]。值得注意的是，在選擇合適的溶劑溶解或消解樣品時(shí)，需考慮樣品的化學(xué)穩(wěn)定性和揮發(fā)性，還應(yīng)考慮樣品中目標(biāo)元素的穩(wěn)定性，避免目標(biāo)元素的損失，比如汞元素和鉑族元素。因此USP<233>規(guī)定，對(duì)這些元素進(jìn)行分析檢測(cè)時(shí)，需在樣品溶液中加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，以保證其穩(wěn)定性[69]。

圖1 USP<233>中元素雜質(zhì)測(cè)定時(shí)樣品的制備方法Fig.1 Preparing method for detection elemental impurity according to USP<233>

2.1 直接溶解法

ICP-OES和ICP-MS的樣品制備優(yōu)先選用無(wú)機(jī)酸或者有機(jī)溶劑水溶液簡(jiǎn)單溶解的制備方法[63,70-72]。根據(jù)USP<233>，可溶性固體和液體樣品可用稀硝酸(HNO3)溶解，如Lásztity等[7]采用0.2 mol/L HNO3處理樣品，通過(guò)ICP-MS測(cè)定了馬來(lái)酸依那普利中的鈀、亞葉酸鈣中的鉑和左旋多巴中的銠；Wang等[9]采用1% HNO3溶解樣品，建立了簡(jiǎn)便、快速、靈敏的原料藥、中間體和藥物中元素雜質(zhì)的定量-半定量方法，Antes等[63]用5%HNO3稀釋場(chǎng)外營(yíng)養(yǎng)液，采用ICP-MS法測(cè)定了其中的元素雜質(zhì)。也有研究將HNO3和HCl混合處理樣品，如Van Hoecke等[71]用0.009 mmol/L KBrO3(含有1%(體積分?jǐn)?shù))HNO3和1%(體積分?jǐn)?shù))HCl)微波輔助消解法測(cè)定了藥物輔料中的元素雜質(zhì)。Fischer等[70]以1%HNO3和0.15% HCl水溶液消解樣品后用ICP-MS快速分析了藥品中的元素雜質(zhì)。

消解樣品時(shí)加入0.1%～1%HCl可以絡(luò)合Hg2+[70-71]、Pd2+[4,71]、Os2+[71]和Pt4+[11]，確保這些離子在溶液中穩(wěn)定，避免延遲效應(yīng)和記憶效應(yīng)。Au3+也可以起到與HCl類似的作用，穩(wěn)定Hg2+和降低記憶效應(yīng)[19]。也可以直接采用濃硝酸溶解來(lái)制備樣品，如經(jīng)7 mol/L HNO3[7]、80%HNO3[4,9,17]消解之后可以直接檢測(cè)[9]或者用水稀釋降低酸的濃度后檢測(cè)[7]。除了液體進(jìn)樣，ICP-OES/MS還可以采用懸浮液霧化進(jìn)樣[73],Zachariadis等用0.5 mol/L的稀硝酸溶解樣品，加入0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)表面活性劑作為穩(wěn)定劑和分散劑，使樣品成為漿液后直接進(jìn)樣，對(duì)粉末狀抗生素中的多元素雜質(zhì)進(jìn)行了分析檢測(cè)[11]。Dennis等[16]采用鹽酸-氯化鉀緩沖液、磷酸鹽緩沖液，在pH 3.0和pH 9.0條件下，以甲醇-水體系提取藥品包裝材料，痕量檢測(cè)了藥包材中的32種元素雜質(zhì)。

對(duì)于不溶于水的樣品，可用有機(jī)溶劑進(jìn)行溶解，如含有2%乙二胺四乙酸鈉(EDTA)的二甲基甲酰胺(DMF)[4]、2-丁氧基乙醇∶水(1∶3，體積比)[8]、二乙二醇單乙醚(DGME)(加入1%硫代乙酰胺作為Pb絡(luò)合劑)[72]、乙醇[74]，經(jīng)溶解、超聲后，不需要進(jìn)一步處理樣品即可直接檢測(cè)。

直接溶解樣品的方法簡(jiǎn)單、操作步驟少，減少了待測(cè)元素的損失，對(duì)于快速篩查和常規(guī)監(jiān)測(cè)元素雜質(zhì)非常重要。采用ICP-OES分析樣品需考慮總固體溶解量(TDS)，常規(guī)分析中，分析溶液的TDS越低越好，一般控制在1%左右，TDS太高易導(dǎo)致炬管堵塞，Lásztity[7]、Lewen[8]、Wang[9]、Jia[17]、Fischer[70]、Al-Ammar[72]等采用了0.1%的樣品濃度，Antes等[63]采用了0.4%和0.5%的樣品濃度。較低的樣品濃度不會(huì)造成儀器過(guò)載，同時(shí)也降低了基體效應(yīng)，減少了譜線干擾。也有文獻(xiàn)報(bào)道采用較高的TDS，比如1%[71]、2.5%[11,63,72]的樣品濃度，這與檢測(cè)使用的儀器和檢測(cè)對(duì)象有關(guān)。

2.2 間接溶解法

因?yàn)樗幤酚葾PI和一些輔料組成，如粘合劑、著色劑、顏料等，這些物質(zhì)很難采用直接溶解的方法消解，因此這樣的樣品需要采用濕法消化間接溶解。濕法消化間接溶解的關(guān)鍵是要確保樣品完全溶解并且有較低的炭殘留(RCC)[75]，重要的是最終樣品溶液的酸度應(yīng)該與參比溶液保持一致，因?yàn)閰⒈热芤旱乃岫容^高時(shí)，分析信號(hào)會(huì)降低[75]。濕法消化有可能會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性元素的損失，如Hg[76]，因此這類樣品最好采用微波消解法消解。相對(duì)于敞開(kāi)式濕法消化，微波消解采用密閉的消解罐，避免了樣品在消解過(guò)程中揮發(fā)性組分的損失，也避免了外部環(huán)境的污染，大多數(shù)藥品都可以只用HNO3消解[77]或者HNO3和H2O2混合消解。Raghuram等[10]用HNO3∶H2O2(7.5∶1，體積比)消解樣品，采用ICP-OES分析了藥物活性成分中的23種金屬元素；Zachariadis[11]用5∶1的HNO3和H2O2消解，ICP-OES法分析了抗生素中的21種元素雜質(zhì)，但值得注意的是，H2O2可能會(huì)因?yàn)樵噭┑募兌葐?wèn)題引起樣品污染[78-79]。也可以用HNO3/H2SO4[80]，或HNO3/HCl[71,81-82]，或HNO3/HCl/H2O2消解樣品[82]。當(dāng)樣品中有二氧化硅(SiO2)、二氧化鈦(TiO2)或者滑石粉(Mg3Si4O10(OH)2)時(shí)，需加HF消解樣品，比如HNO3∶HCl∶HF(3∶3∶1，體積比)[15]和HNO3∶HCl∶HF(2∶2∶1，體積比)[82]。

消解之后的樣品一般用純水進(jìn)行稀釋[13,70,77]，但由于Hg、Os和Pd在氧化性溶劑中揮發(fā)而不穩(wěn)定，可采用稀鹽酸(<0.5%)稀釋[70-71,82]，且 Os和Pd因?yàn)槭軜悠坊|(zhì)的影響，稀釋時(shí)需額外加入穩(wěn)定劑以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，比如含有硫脲(0.01 mol/L)和抗壞血酸(0.1 g/L)的0.5%乙酸[83]，含有0.009 mmol/L KBrO3[71]或者0.01 mol/L硫脲[70]的1%HCl。

無(wú)論采用哪種方法制備樣品，均需加標(biāo)回收以確保方法的可行性和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與展望

元素雜質(zhì)控制是藥品質(zhì)量安全保證的重要研究?jī)?nèi)容之一，根據(jù)《美國(guó)藥典》的新通則USP<232>、USP<233>和ICH Q3D的元素雜質(zhì)指南，現(xiàn)行的重金屬檢測(cè)方法在檢測(cè)范圍、準(zhǔn)確性、靈敏度和專屬性等方面均不能滿足要求，其必將被ICH Q3D推薦的ICP-MS和ICP-OES所取代。ICP-MS似乎是最適合于藥物中元素分析的技術(shù)手段，但I(xiàn)CP-MS靈敏度非常高，因此存在的干擾也比ICP-OES多，實(shí)際應(yīng)用中如何消除這些干擾是關(guān)鍵。相比較于ICP-MS，ICP-OES雖然靈敏度較低，但干擾相對(duì)較少，并且具有操作簡(jiǎn)便，高通量等優(yōu)點(diǎn)，因此選擇哪一種方法分析元素雜質(zhì)還要考慮檢測(cè)目的和檢測(cè)限度的要求。

隨著中國(guó)正式加入ICH，中國(guó)藥品的監(jiān)管政策也必須遵循ICH的指南和標(biāo)準(zhǔn)。2015版《中國(guó)藥典》重金屬檢查主要用于金屬總量的控制，在中國(guó)與國(guó)際接軌的新形式下，下一版中國(guó)藥典必將出現(xiàn)元素雜質(zhì)的檢測(cè)方法。符合ICH Q3D要求，是中國(guó)創(chuàng)新藥走向國(guó)際市場(chǎng)的硬性條件，無(wú)論是中國(guó)制藥企業(yè)還是監(jiān)管部門，根據(jù)ICH Q3D的不同元素PDE值和不同服藥途徑，建立或評(píng)審原輔料或藥物成品的元素限度，已經(jīng)勢(shì)在必行。