侯 靖，劉夢婷，盧躍鵬，王 澍，周瑋婧

(武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430012)

橄欖油的真?zhèn)渭捌焚|(zhì)判別一直倍受關(guān)注，國際橄欖油協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)COI/T.15/NC No 3/Rev.14及國際食品法典CODEX STAN 33-1981將橄欖油主要劃分為初榨橄欖油和精煉橄欖油，其中初榨橄欖油要求采用機(jī)械壓榨等物理方式直接從油橄欖果實(shí)中榨取油脂，并根據(jù)油脂的質(zhì)量分為多個(gè)等級;對質(zhì)量不符合要求的初榨橄欖油，可通過精煉的方式獲得精煉橄欖油。品質(zhì)不良及貯藏不當(dāng)?shù)拈蠙旃麜l(fā)酵產(chǎn)生乙醇，從而與游離脂肪酸反應(yīng)生成脂肪酸乙酯。因橄欖油中含有較高的棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸，所以主要生成棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯等。已有研究經(jīng)感官評定發(fā)現(xiàn)有發(fā)酵缺陷的橄欖油中脂肪酸甲酯和乙酯的含量較高[1]，因此，國際橄欖油協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)COI/T.15/NC No 3/Rev.14中規(guī)定特級初榨橄欖油中脂肪酸乙酯含量不得超過35 mg/kg，而歐盟標(biāo)準(zhǔn)(EU) No 1348/2013規(guī)定2015年后生產(chǎn)的特級初榨橄欖油中脂肪酸乙酯含量不得超過30 mg/kg。

目前，橄欖油中脂肪酸乙酯的檢測普遍采用國際橄欖油協(xié)會的COI/T.20/Doc.No 31方法，但該方法使用硅膠層析柱凈化，氣相色譜法測定，需手動填裝層析柱，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，不利于大批量檢測。已有文獻(xiàn)報(bào)道的氣相色譜法[2]及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]雖大大簡化了樣品前處理步驟，減少了溶劑的使用，但其采用的固相萃取及氮吹濃縮依舊耗時(shí)費(fèi)力。其他報(bào)道如Boggia等[4]以熱解吸結(jié)合冷凍聚焦進(jìn)樣，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測橄欖油中的脂肪酸烷基酯，方法無需前處理，但需加裝熱脫附和冷進(jìn)樣系統(tǒng)，不利于普及;Berardinelli等[5]采用時(shí)域反射計(jì)在線采集橄欖油的時(shí)域反射信號，再經(jīng)過快速傅立葉轉(zhuǎn)換等數(shù)據(jù)處理，對橄欖油中的脂肪酸烷基酯含量進(jìn)行測定，但其得到的為多種脂肪酸乙酯的總量，并不能分析出每個(gè)化合物的具體含量。

熱分離進(jìn)樣是一種通過氣化溫度差異直接分析固體及液體試樣的技術(shù)，待測組分在進(jìn)樣口發(fā)生氣化時(shí)，高沸點(diǎn)或不揮發(fā)的基質(zhì)保留在一次性微量進(jìn)樣瓶中，從而實(shí)現(xiàn)待測物與基質(zhì)的分離[6]。使用該技術(shù)只需將熱分離進(jìn)樣桿適配器安裝在進(jìn)樣口即可，對于分流/不分流進(jìn)樣口，需快速插入進(jìn)樣桿以避免樣品過早氣化[7]，可使用具有程序升溫功能的進(jìn)樣口以避免該情況的發(fā)生。熱分離進(jìn)樣技術(shù)已被用于固體樣品中揮發(fā)性成分的檢測[8]，如與微吸附采樣技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于大氣污染物的快速檢測[9]，與吸附萃取攪拌棒聯(lián)合使用用于火場空氣中助燃劑的檢測[10]以及槍支射擊殘留物的檢測[11-12]。本研究首次采用熱分離進(jìn)樣技術(shù)對橄欖油中的脂肪酸乙酯進(jìn)行測定，可為橄欖油品質(zhì)快速鑒別提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-7010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，配多模式進(jìn)樣口；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Vortex-Genie 2渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司)；熱分離進(jìn)樣套件及玻璃微量樣品瓶購于美國Agilent公司。

正己烷(色譜純，德國Merck公司)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：棕櫚酸乙酯(Palmitic acid ethyl ester)、硬脂酸乙酯(Stearic acid ethyl ester)、油酸乙酯(Oleic acid ethyl ester)、亞油酸乙酯(Linoleic acid ethyl ester)、十七烷酸甲酯(Heptadecanoic acid methyl ester，內(nèi)標(biāo))純度均大于99%，購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；特級初榨橄欖油質(zhì)控樣(材料代碼：PT-FC-790-X，英國LGC公司)。精煉橄欖油(作為空白基質(zhì))及特級初榨橄欖油，均購自武漢市場。

1.2 溶液配制

1.2.1 脂肪酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯各100 mg(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用時(shí)取10 μL，用正己烷定容至1 mL，配成10 μg/mL的脂肪酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取十七烷酸甲酯100 mg(精確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，制成1 000 mg/L內(nèi)標(biāo)儲備液。臨用時(shí)取內(nèi)標(biāo)儲備液10 μL，用正己烷定容至1 mL，得10 mg/L的十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 樣品制備

精確稱取0.1 g油脂樣品于10 mL容量瓶中，加入100 μL十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷定容至刻度，渦旋振蕩使樣品充分溶解并混勻，再用移液槍吸取10 μL樣品溶液至玻璃微量樣品瓶中，室溫放置約2 h，使溶劑自然揮發(fā)。將揮干溶劑的樣品瓶放入熱分離進(jìn)樣套件的樣品桿內(nèi)，并將進(jìn)樣桿插入進(jìn)樣口中，擰緊后開始進(jìn)樣分析。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件采用DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱1)連接進(jìn)樣口和反吹裝置；采用空毛細(xì)管色譜柱(1 m×0.15 mm，柱2)連接反吹裝置和質(zhì)譜儀；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口初始溫度60 ℃，保持0.1 min，以600 ℃/min升溫至220 ℃，保持至分析結(jié)束；載氣為高純氦氣(純度>99.999%)。柱1為恒流模式，流速1.2 mL/min；柱2為恒壓模式，壓力為34.47 kPa；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，最后以 20 ℃/min升至280 ℃，數(shù)據(jù)采集結(jié)束后，再迅速升溫至300 ℃進(jìn)行反吹；反吹壓力344.7 kPa，進(jìn)樣口壓力關(guān)閉，反吹5 min；傳輸線溫度300 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件電離方式為電子轟擊源(EI)；電離能量70 eV；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間8 min；監(jiān)測方式為選擇離子監(jiān)測(SIM)，各化合物CAS號、保留時(shí)間、定量及定性離子信息見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)樣溫度的選擇

熱分離進(jìn)樣主要利用目標(biāo)物和基質(zhì)的沸點(diǎn)差異進(jìn)行分離，因此選擇合適的進(jìn)樣口溫度是方法建立的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)先將載有微量樣品瓶的進(jìn)樣口升溫至某一溫度進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，記錄4種脂肪酸乙酯的峰面積；不取出微量樣品瓶，繼續(xù)將進(jìn)樣口溫度升至300 ℃再次采集數(shù)據(jù)記錄各化合物的峰面積，以第一次進(jìn)樣峰面積與兩次進(jìn)樣峰面積之和的百分比為該溫度下的進(jìn)樣率。結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)樣口溫度為200 ℃時(shí)，4種化合物進(jìn)樣率均低于90%；當(dāng)進(jìn)樣口溫度為220 ℃時(shí)，4種化合物進(jìn)樣率均在90%以上，且繼續(xù)提高進(jìn)樣溫度，進(jìn)樣率提升不明顯；考慮到進(jìn)樣口溫度越高，基質(zhì)氣化進(jìn)入色譜柱的可能性越大，因此在滿足目標(biāo)化合物充分氣化的前提下，應(yīng)盡可能選擇較低的進(jìn)樣口溫度。另外，實(shí)驗(yàn)還比較了進(jìn)樣口溫度為220 ℃時(shí)進(jìn)樣前后微量樣品瓶中的油滴情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該溫度下進(jìn)樣時(shí)樣品基質(zhì)基本無揮發(fā)。故本實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)樣溫度為220 ℃。

2.2 色譜條件優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，樣品檢測從連續(xù)進(jìn)樣的第2個(gè)樣品開始，總離子流圖位的14.5 min處出現(xiàn)一較大的共流出化合物峰，影響目標(biāo)物定量準(zhǔn)確性，并污染儀器。通過對全掃描模式采集的數(shù)據(jù)及NIST譜庫檢索結(jié)果確認(rèn)發(fā)現(xiàn)其為角鯊烯，這是因?yàn)榻酋徬┰陂蠙煊椭泻亢芨遊13-14]，且為高沸點(diǎn)物質(zhì)，易在色譜柱中殘留。已有研究表明，柱后反吹技術(shù)可降低基質(zhì)影響，并有效地縮短分析時(shí)間[15]，因此實(shí)驗(yàn)選擇在升溫程序結(jié)束后，繼續(xù)升高溫度并進(jìn)行柱后反吹，即在分析結(jié)束后提高色譜柱后的氦氣壓力，并降低進(jìn)樣口的氦氣壓力，使色譜柱中的氦氣反向流動，將殘留的高沸點(diǎn)物質(zhì)從分流出口吹出。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法顯著降低了角鯊烯的干擾，優(yōu)化條件下4種脂肪酸乙酯的加標(biāo)總離子流圖見圖1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect)指的是樣品中除分析物以外的組分對分析結(jié)果的干擾，本研究以化合物的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯及硬脂酸乙酯的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)分別為0.59、0.43、0.47和0.39，4種化合物均表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

取空白基質(zhì)，向其中添加一定量脂肪酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配成4種脂肪酸乙酯質(zhì)量濃度為0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下處理并測定。結(jié)果顯示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，4種脂肪酸乙酯與內(nèi)標(biāo)的相對含量(x)與對應(yīng)的相對峰面積(y)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不低于0.999 6。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得4種脂肪酸乙酯的LOD均為0.3 mg/kg，LOQ均為1.0 mg/kg(表2)，可滿足橄欖油中脂肪酸乙酯的檢測需求。

表2 4種脂肪酸乙酯的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,recoveries,relative standard deviations(RSDs),limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of 4 fatty acid ethyl esters

2.5 回收率與重復(fù)性

向空白基質(zhì)中添加1.0、2.0、10 mg/kg的4種脂肪酸乙酯進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行6次，在優(yōu)化條件下處理后測定。結(jié)果顯示，4種脂肪酸乙酯在低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度下的回收率為82.4%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.68%～6.8%(表2)，表明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 實(shí)際樣品及質(zhì)控樣品的檢測

在優(yōu)化條件下，對市售特級初榨橄欖油樣品(8批次)和質(zhì)控樣品分別采用本方法和SPE/GC-MS法[3]進(jìn)行測定(表3)。結(jié)果顯示，本方法與SPE/GC-MS法測定結(jié)果無明顯差異，兩種方法測定同一樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)；質(zhì)控樣中脂肪酸乙酯的指定值為32 mg/kg，滿意范圍為20.0～43.0 mg/kg，本方法與SPE/GC-MS方法的檢測結(jié)果相差不大，且均在質(zhì)控樣給定滿意范圍內(nèi)，表明本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。其中1號橄欖油樣品的總離子流圖見圖2。

表3 不同樣品中4種脂肪酸乙酯之和檢出情況Table 3 Detection of sum of 4 fatty acid ethyl esters in different samples (mg/kg)

圖2 1號橄欖油樣品中4種脂肪酸乙酯的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 4 fatty acid ethyl esters in sample No.1*.heptadecanoic acid methyl ester,1.palmitic acid ethyl ester, 2.linoleic acid ethyl ester,3.oleic acid ethyl ester, 4.stearic acid ethyl ester

3 總 結(jié)

本文采用熱分離進(jìn)樣技術(shù)，通過優(yōu)化儀器進(jìn)樣溫度，建立了一種無需前處理直接測定橄欖油中4種脂肪酸乙酯的方法。該方法簡便快捷，具有靈敏度高，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。通過對實(shí)際樣品及質(zhì)控樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)該方法與傳統(tǒng)的固相萃取(SPE)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)方法檢測結(jié)果相近，可替代傳統(tǒng)方法用于橄欖油中脂肪酸乙酯的快速檢測。