姜 冰，丁 濤，曹崇江，寧曉盼，吳 斌，唐茂芝，王茂華

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京 210001；3.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局認(rèn)證認(rèn)可技術(shù)研究中心，北京 100020)

吡咯里西啶類(lèi)生物堿(Pyrrolizidine alkaloids,PAs)是廣泛存在于植物中的含氮堿性化合物，可引起人和牲畜的肝毒性，尤其是PAs的代謝活化產(chǎn)物具有肝臟損傷、致癌和致發(fā)育等多種毒性作用[1-2]。PAs對(duì)哺乳動(dòng)物本身并無(wú)明顯毒性，當(dāng)肝臟的正常氧化解毒機(jī)制將其轉(zhuǎn)化為吡咯代謝產(chǎn)物(脫氫生物堿)時(shí)，它們作為食物或飼料成分時(shí)的危害開(kāi)始產(chǎn)生[3]。因此，PAs的中毒案例時(shí)有發(fā)生。動(dòng)物源性食品如蜂蜜、牛奶、雞蛋和動(dòng)物內(nèi)臟很容易含有PAs，蜂蜜中檢出PAs在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[4-7]。Bodi等[8]在中草藥和茶葉中檢出較高含量的PAs，但對(duì)于動(dòng)物源性食品中是否含有PAs及其含量檢測(cè)的研究仍較為缺乏。

對(duì)于PAs的檢測(cè)方法通常有分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、核磁共振法[11]、免疫學(xué)方法[12]、高效液相色譜法[13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]等。分光光度法和薄層色譜法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中PAs的痕量分析缺乏敏感性和選擇性；氣相色譜法也存在熱分解不穩(wěn)定等不足；而免疫學(xué)方法通常只對(duì)結(jié)構(gòu)上緊密相關(guān)的一小部分PAs敏感[16]。隨著液相色譜-質(zhì)譜儀器檢測(cè)能力的不斷提高，該聯(lián)用技術(shù)在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用日益廣泛，極大地有助于對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中痕量天然產(chǎn)物的明確識(shí)別和定量，被應(yīng)用于多種PAs的同時(shí)檢測(cè)[17-19]。近年來(lái)，陸續(xù)有研究人員通過(guò)固相萃取凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法開(kāi)展PAs的檢測(cè)分析[20-22]。

本文通過(guò)MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定，建立了同時(shí)定量測(cè)定蜂蜜、乳制品、動(dòng)物內(nèi)臟等動(dòng)物源性食品中倒千里光堿、野百合堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿、克氏千里光寧堿、立可沙明堿、天芥菜堿、毛果天芥菜堿、藍(lán)薊定9種PAs(如圖1所示)含量的方法，并進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察和實(shí)際樣品分析。該方法具有樣品制備簡(jiǎn)單和用量少、所需試劑少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性食品中PAs的快速和高效準(zhǔn)確測(cè)定。

圖1 9種PAs的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecule structures of 9 PAs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB Sciex QTRAP 4500 LC-MS/MS系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX公司)，Smart N15VF超純水系統(tǒng)(力康生物公司)，WH-3微型渦旋混合儀(上海滬西公司)，SIGMA 2-16PK型高速冷凍離心機(jī)(北京博勵(lì)行公司)，MSE 125P型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)，KH-500SP雙頻數(shù)控超聲波清洗器(禾創(chuàng)超聲公司)，SPE432型全自動(dòng)固相萃取儀(普立泰科公司)，Auto Vap s60型氮吹濃縮儀(美國(guó)ATR公司)。

甲醇(色譜純，美國(guó)Honeywell公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；MCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，Waters公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：野百合堿(純度100%)、立可沙明堿(純度100%)、倒千里光堿(純度99.8%)、天芥菜堿(純度90.98%)、千里光菲靈堿(純度99.78%)、千里光寧堿(純度100%)、藍(lán)薊定(純度96.62%)、克氏千里光寧堿(純度97.16%)、毛果天芥菜堿(純度98.4%)均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。用甲醇將各生物堿標(biāo)準(zhǔn)品溶解，稀釋并定容獲得1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)需要用甲醇將其儲(chǔ)備液稀釋至10 μg/mL作為中間工作儲(chǔ)備液。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 蜂蜜樣品的提取稱(chēng)取2 g(精確至0.01 g)試樣置于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 0.05 mol/L鹽酸提取溶液，加入1 mL三氯甲烷去蛋白，渦旋混合均勻，8 000 r/min離心3 min，取上清液準(zhǔn)備凈化。

1.2.2 乳制品樣品的提取稱(chēng)取5 g(精確至0.01 g)樣品置于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中(乳粉樣品加入5 mL水)，加入10 mL 5%三氯乙酸，渦旋混合均勻，8 000 r/min離心3 min，過(guò)濾(定性濾紙)后準(zhǔn)備凈化。

1.2.3 動(dòng)物肝臟樣品的提取稱(chēng)取1 g(精確至0.01 g)樣品置于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋混合均勻，超聲提取20 min，8 000 r/min離心3 min，過(guò)濾(定性濾紙)后準(zhǔn)備凈化。

1.2.4 樣品凈化將上述待凈化樣品轉(zhuǎn)移至Waters Oasis MCX固相萃取柱(預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化)中，棄去廢液，依次用5 mL水和3 mL甲醇淋洗，加入5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.0 mL甲醇-水(1∶9，體積比)溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.5 色譜參數(shù)色譜柱：Phenomenex Kinetex C18(4.6 mm× 100 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨(B)；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～3.5 min，10% A；3.5～6.5 min，10%～90% A；6.5～10.0 min，90% A；10.0～10.1 min，90%～10% A；10.1～13.0 min，10% A。

1.2.6 質(zhì)譜參數(shù)離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子掃描；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化氣壓力(GS1)：379 kPa(55 psi)；氣簾氣壓力(GS2)：379 kPa(55 psi)；輔助氣壓力(CUR)：241 kPa(35 psi)；離子源溫度(TEM)：550 ℃；其它質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 9種PAs的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 9 PAs

*:quantitation ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

PAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)為含氮的堿性環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此采用C18反相色譜柱，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行分離和測(cè)定。本文考察了4種不同流動(dòng)相(甲醇-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨)的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用甲酸酸化的水相體系可使峰形更尖銳，峰形改善明顯。由于使用甲醇配制PAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此選擇甲醇做流動(dòng)相的分離效果優(yōu)于乙腈。本文最終選擇甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。按“1.2.5”進(jìn)行梯度洗脫，9種PAs標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/L)的總離子流圖及各PAs的選擇離子流圖如圖2所示。

2.2 質(zhì)譜條件的考察

對(duì)PAs標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行稀釋?zhuān)⒉捎昧鲃?dòng)注射方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子峰，再分別以待測(cè)化合物的分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描。選擇兩個(gè)特征子離子，其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)，獲得的最佳質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

圖2 9種PAs標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/L)的總離子圖及選擇離子流圖Fig.2 Total ion and selected ion chromatograms of 9 PAs standard solutions(200 μg/L)

圖3 不同固相萃取柱對(duì)9種PAs的凈化效果Fig.3 Purification results of 9 PAs by different solid phase extraction columns

2.3 提取條件的選擇

考察了不同溶劑對(duì)不同基質(zhì)的去蛋白效果以及不同體積提取液的提取效果。對(duì)于蜂蜜基質(zhì)，三氯甲烷的去蛋白效果明顯優(yōu)于5%三氯乙酸，而乳制品采用5%三氯乙酸的去蛋白效果較好，對(duì)于動(dòng)物肝臟，提取液1%乙酸乙腈本身具有去蛋白效果，因此無(wú)需另加三氯甲烷或三氯乙酸去蛋白。測(cè)試了不同提取液體積(5、10、15 mL)對(duì)基質(zhì)的提取效果，結(jié)果表明，采用5 mL提取液進(jìn)行提取時(shí)，PAs的回收率較低，由于15 mL和10 mL提取液的回收率差別不大，為了減少提取溶液的使用量，最終選擇10 mL提取液。

2.4 固相萃取凈化的選擇

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，通常采用液-液萃取、固相萃取等凈化方式降低背景干擾，減少基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)考察了基于改性聚合物固相萃取柱(Waters Oasis HLB，60 mg/3 mL)和強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)兩種類(lèi)型固相萃取柱的凈化效果，在0.05 mol/L鹽酸溶液中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并轉(zhuǎn)移至活化的固相萃取柱，HLB小柱通過(guò)5 mL水淋洗，5 mL甲醇洗脫的方式進(jìn)行凈化，MCX小柱通過(guò)水和甲醇一次淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫的方式進(jìn)行凈化。結(jié)果如圖3所示，天芥菜堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿、克氏千里光寧堿、毛果天芥菜堿、藍(lán)薊定在兩種固相萃取柱的回收率均大于70%，然而野百合堿、立可沙明堿和倒千里光堿在采用HLB固相萃取柱時(shí)凈化回收率小于60%。此外，由于PAs在酸性條件下其叔胺基團(tuán)易形成陽(yáng)離子，因此，最終采用強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)進(jìn)行富集和凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)對(duì)待測(cè)組分在儀器中的響應(yīng)信號(hào)會(huì)有不同程度的抑制或增強(qiáng)，使檢測(cè)方法的檢出限、定量下限和精密度等受到影響[23]。本文采取提取后添加法考察了蜂蜜、乳制品及動(dòng)物肝臟中基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響程度，基質(zhì)效應(yīng)(ME)計(jì)算如下：ME=A/B×100%，其中A為空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，B為甲醇中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積。基質(zhì)抑制時(shí)，ME<1；基質(zhì)增強(qiáng)時(shí)，ME>1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9種待測(cè)生物堿在蜂蜜、乳制品和動(dòng)物肝臟基質(zhì)中的ME為0.42～0.83。為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液外標(biāo)法進(jìn)行定量，即樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用空白樣品的提取液作為稀釋液，使其均具有相同的離子化條件。

2.6 線(xiàn)性關(guān)系、回收率與定量下限

在基質(zhì)溶液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其質(zhì)量濃度分別為0、10、20、50、100 ng/mL，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下考察了9種PAs的線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果顯示，9種PAs在0～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r>0.99)。以信噪比(S/N)大于3為方法檢出限(LOD),信噪比(S/N)大于10且回收率和精密度較好的最低加標(biāo)濃度為方法定量下限(LOQ)，得到9種PAs的LOD均為3 μg/kg,LOQ均為10 μg/kg。對(duì)洋槐蜜、麥盧卡蜂蜜、液態(tài)乳、乳粉及雞肝等動(dòng)物源性食品分別進(jìn)行3個(gè)水平(10、20、50 μg/kg)的加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定6次。由表2可知，9種PAs在不同加標(biāo)水平的回收率為71.0%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.0%～9.8%。不同品種的蜂蜜加標(biāo)回收率有所不同，麥盧卡蜂蜜相對(duì)洋槐蜜的加標(biāo)回收率較低；對(duì)于乳制品，液態(tài)乳的加標(biāo)回收率相對(duì)高于固態(tài)奶粉的回收率。同種基質(zhì)中不同PAs的加標(biāo)回收率也有區(qū)別，譬如，在洋槐蜜中千里光寧堿和藍(lán)薊定的加標(biāo)回收率相對(duì)較高。

表2 5種不同種類(lèi)基質(zhì)中9種PAs的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of nine PAs spiked in 5 kinds of samples(n=6)

the number denoted was the same as that in Table 1

2.7 實(shí)際樣品的分析

采用本方法對(duì)21種蜂蜜、16種乳制品和3種動(dòng)物肝臟中的9種PAs進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分樣品均未檢出或檢出含量較小，而在麥盧卡蜂蜜中檢出立可沙明堿、天芥菜堿、千里光菲靈堿、藍(lán)薊定和毛果天芥菜堿，含量為3.4～8.9 μg/kg。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)酸性溶液提取，MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測(cè)，外標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蜂蜜、乳制品、動(dòng)物內(nèi)臟等動(dòng)物源性食品中9種PAs含量的同時(shí)測(cè)定。該方法具有樣品與試劑用量少、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。選取的基質(zhì)對(duì)方法雖具有一定干擾，但使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法后，回收率高，適用于蜂蜜、乳制品、肝臟等動(dòng)物源性食品中9種PAs的測(cè)定。