邢芳毓，高建萍，張貴鋒*，王明林*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，對于維持組織的機(jī)械穩(wěn)定性具有重要作用[1-3]。目前已發(fā)現(xiàn)的膠原有29種[4]，均為3條肽鏈組成的右旋三螺旋結(jié)構(gòu)，且三螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)的肽鏈由規(guī)則重復(fù)的每2個(gè)氨基酸出現(xiàn)1個(gè)甘氨酸的序列組成。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其相互交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與其它蛋白及多糖類結(jié)合，以給予細(xì)胞和組織一定的機(jī)械強(qiáng)度和支撐。膠原具有低免疫原性、生物相容性、止血性和可生物降解性等生物性能，使其在生物醫(yī)學(xué)中成為最常用的材料之一，如藥物輸送系統(tǒng)、傷口敷料、皮膚、血管等產(chǎn)品[5-8]。因此，在膠原相關(guān)的研究中，膠原的定量分析成為產(chǎn)品研發(fā)及質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

目前膠原的定量方法眾多，如毛細(xì)管電泳法[9]、比色法[10]、高效液相色譜法[11]和免疫學(xué)檢測法[12]等，但在定量的準(zhǔn)確性等方面均存在一定局限性。例如，基于羥脯氨酸的定量方法，只能測得總膠原含量，無法區(qū)分不同類型膠原；酶聯(lián)免疫吸附測定法要求樣品為中性溶液，但大部分膠原為酸溶性，中性條件下幾乎不溶，極大地影響檢測的準(zhǔn)確度；利用免疫熒光染色定量組織中的膠原，需進(jìn)行組織切片，而Ⅰ型和Ⅲ型膠原在皮膚真皮層中分布不均勻[13]，另外該方法利用圖像軟件分析染色結(jié)果，準(zhǔn)確度較低，誤差較大。

離子阱質(zhì)譜具有多級(jí)質(zhì)譜功能，可以分析化合物結(jié)構(gòu)，對多肽的序列進(jìn)行識(shí)別[14]。不同物種、不同類型膠原的氨基酸序列彼此不同，可用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)識(shí)別出不同類型膠原中的特征多肽，從而實(shí)現(xiàn)膠原的類型識(shí)別[15]。三重四極桿質(zhì)譜同樣可用于結(jié)構(gòu)分析，其比離子阱質(zhì)譜靈敏，更適用于微量物質(zhì)的定量分析[16]。胰蛋白酶降解過程中膠原的斷裂具有一定規(guī)律性(胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)在精氨酸或賴氨酸的羧端)，在相同的酶解條件下，可根據(jù)特征肽段的序列進(jìn)行膠原定量。本文基于高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)，在比較不同類型的牛膠原氨基酸序列的基礎(chǔ)上，篩選出牛Ⅰ型膠原的特征肽段，并利用特征肽段對市售膠原海綿樣品中的牛Ⅰ型膠原進(jìn)行定量，為膠原的準(zhǔn)確定量提供了方法依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

液相色譜-離子阱質(zhì)譜由1100液相色譜(美國Agilent公司)和LCQ DecaXP電噴霧質(zhì)譜(美國Thermo Fisher公司)組成；高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜由U3000液相色譜、TSQ Quantum ACCESS MAX質(zhì)譜(美國Thermo Fisher公司)組成；數(shù)據(jù)采集與處理軟件為Xcalibur1.3。

1.2 材料與試劑

牛Ⅰ型膠原海綿(河北考力森生物科技有限公司)；胰蛋白酶(序列純，豬源，Promega公司)；乙腈、甲醇(色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜純，Aladdin公司)；GFSGLDGAK特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.28%，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)；碳酸氫銨(NH4HCO3，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.3 樣品前處理?xiàng)l件

取膠原海綿樣品10 mg加入10 mL NH4HCO3緩沖液(0.05 mol/L)，于沸水浴中加熱20 min，待冷卻至常溫后，加入胰蛋白酶(200 μg)，37 ℃酶解16 h，再于沸水浴中加熱5 min使胰酶滅活，離心(10 000 r/min)10 min，待上樣。

1.4 凝膠過濾分析條件

色譜條件參考文獻(xiàn)方法[17]。

1.5 液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為水(0.1%甲酸)，B為乙腈(0.1%甲酸)；洗脫梯度：0～5 min，5% B；5～40 min，5%～40% B；40～80 min，40%～75% B；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件ESI電離；噴霧電壓：4.5 kV；鞘氣流速：約400 kPa(60 arb)；掃描范圍(m/z)：300～2 000；正離子監(jiān)測模式；精確質(zhì)量數(shù)掃描(Zoom scan)和二級(jí)質(zhì)譜掃描(MS/MS)均為數(shù)據(jù)依賴性掃描；二級(jí)質(zhì)譜的碰撞能量為35%。

1.6 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

1.6.1 色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm,5 μm)；流動(dòng)相：A為水(0.1%甲酸)；B為60%乙腈+40%水(0.1%甲酸)；洗脫梯度：0～25 min，5%～50% B；25～26 min，50%～90% B；26～35 min，90% B；35～36 min，90%～5% B；36～45 min，5% B；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇離子監(jiān)測(m/z851.4)；噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣壓力：241.3 kPa；輔助氣壓力：約1.2 kPa(8 arb)；鞘氣輔助氣壓力：0.6 MPa；離子傳輸管溫度：270 ℃;離子源蒸發(fā)溫度：100 ℃。

1.7 水分與熾灼殘?jiān)鼫y定

按照《中華人民共和國藥典》[18]中0832和0841規(guī)定的方法進(jìn)行。

圖1 膠原海綿酶解產(chǎn)物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of digested collagen sponge

2 結(jié)果與討論

2.1 牛Ⅰ型膠原特征多肽的篩選

膠原海綿樣品經(jīng)序列純胰蛋白酶酶解后產(chǎn)生大量有斷裂規(guī)律的低分子量多肽，將酶解后樣品用離子阱質(zhì)譜(LCQ)進(jìn)行分析，得到牛Ⅰ型膠原酶解多肽的總離子流圖(圖1)。利用BLAST進(jìn)行膠原多序列比對，發(fā)現(xiàn)牛Ⅰ型膠原存在一定數(shù)量的特征多肽。利用Bioworks軟件對質(zhì)譜信息用SEQUEST進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，多肽篩選參數(shù)為Xcorr>1.5(單電荷)，Xcorr>2.0(雙電荷)，篩選出的陽性肽段見表1。然后結(jié)合手工檢查確認(rèn)譜圖質(zhì)量，例如離子豐度、b離子和y離子之間匹配度等。同時(shí)確保肽段短小，羥基化修飾位點(diǎn)低。依據(jù)以上條件，篩選出多肽GFSGLDGAK為牛Ⅰ型膠原的特征肽段。圖2和圖3分別為該肽段的提取離子流圖和質(zhì)譜圖，該肽段的提取離子流圖有較高的豐度，且二級(jí)離子碎片與理論值的匹配度較高。故選擇該肽段為牛Ⅰ型膠原的特征肽段，用于牛Ⅰ型膠原的類型識(shí)別與定量。

表1 牛Ⅰ型膠原的陽性肽段信息Table 1 Positive peptide information of bovine Ⅰtype collagen

P*is hydroxyproline

圖2 特征肽段的提取離子色譜圖和一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram and mass spectrum of marker peptide

圖3 特征肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of marker peptide

2.2 樣品前處理分析

膠原海綿樣品經(jīng)過2次沸水浴加熱前處理，一次是酶解前加熱使膠原解旋變性，另一次是酶解后加熱使胰酶滅活。本研究利用肽段對膠原進(jìn)行定量，需確保除酶解釋放肽段外，其他步驟不會(huì)發(fā)生肽鍵斷裂。對不同相對分子質(zhì)量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品以及膠原海綿經(jīng)沸水浴加熱20 min后的樣品進(jìn)行凝膠過濾分析，凝膠過濾色譜圖分別見圖4A和4B。由圖4A中不同蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量與對應(yīng)的保留時(shí)間計(jì)算得出，圖4B中2個(gè)色譜峰的相對分子質(zhì)量分別約為276 kDa與138 kDa。文獻(xiàn)研究顯示，加熱后膠原變性，三螺旋解旋形成明膠，3條肽鏈完全松開或1條肽鏈松開，任意2條肽鏈由少量氫鍵連接，牛I型膠原的單條肽鏈相對分子質(zhì)量為138 kDa(UniProtKB)，這與本文的凝膠過濾檢測結(jié)果符合。同時(shí)圖4B中無其他雜峰，表明短時(shí)間的加熱并未使膠原肽鏈破碎，未產(chǎn)生低分子肽段。酶解后，利用“1.6”方法對未加熱滅活和加熱滅活的樣品進(jìn)行檢測(圖5)，特征肽段的峰面積相似，酶解肽未因加熱而導(dǎo)致進(jìn)一步水解。

圖4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(A)與膠原海綿樣品(B)的凝膠過濾色譜圖Fig.4 Gel filtration chromatograms of protein standards(A) and collagen sample(B)A.1:430 kDa,2:200 kDa,3:150 kDa,4:69 kDa,5:29 kDa;B.1:276 kDa,2:138 kDa

圖5 特征肽段的選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.5 SIM chromatograms of marker peptideA:non-inactivated enzymatic sample;B:inactivated enzymatic sample

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍將特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.645、1.29、3.225、19.2、6.45、12.9、21.5 μg/mL，按照“1.6”條件進(jìn)樣分析。以多肽標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/mL)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制校正曲線。結(jié)果顯示，特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品在0.645～21.5 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=6.39×109x-1.73×106，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 4。

2.3.2 定量下限精密量取特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水逐步稀釋，定容，搖勻。按照“1.6”條件每個(gè)樣品進(jìn)樣2針，記錄色譜圖。以信噪比為10∶1時(shí)為定量下限，測得牛Ⅰ型特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品的定量下限為6.45×10-4μg/mL。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the sample recovery experiment

2.3.3 回收率在1 mg/mL的膠原海綿酶解液中加入3.10、2.48、1.55 μg/mL的多肽標(biāo)準(zhǔn)品，按照“1.6”條件進(jìn)樣分析，并計(jì)算回收率。由表2可知，3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為98.2%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在10%以內(nèi)，表明本方法可行。

2.3.4 精密度取特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液,注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按照“1.6”條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖,計(jì)算峰面積的RSD為0.80%，說明儀器精密度良好，能夠滿足樣品含量測定需求。

表3 膠原海綿均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)Table 3 Measurement data of the uniformity test of collagen standards

表4 膠原標(biāo)準(zhǔn)品的均勻性考察方差分析Table 4 Analysis of variance for collagen standard uniformity

圖6 膠原海綿中牛Ⅰ型膠原含量Fig.6 Content of bovine type Ⅰ collagen in collagen spongeA：4 ℃；B：25 ℃；C：37 ℃；D：-20 ℃

表5 不同實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果Table 5 Test results from different laboratories

2.4 牛Ⅰ型膠原含量檢測

2.4.1 均勻性膠原海綿樣品共210支，按順序編號(hào)后，采用EXCEL軟件生成隨機(jī)數(shù)的方法，隨機(jī)抽取15支樣品，分別編號(hào)為S1、S2……S15。每個(gè)抽取樣品按“1.6”方法重復(fù)測定2次，分析組間方差和組內(nèi)方差，以評價(jià)樣品的瓶內(nèi)與瓶間的均勻性。采用F檢驗(yàn)，評估樣品的均勻性在單元內(nèi)及單元間是否存在顯著性差異。檢測結(jié)果及方差分析結(jié)果見表3與表4。

經(jīng)計(jì)算，統(tǒng)計(jì)量F=3.14，該統(tǒng)計(jì)量是自由度為(14，15)的F分布變量。根據(jù)自由度(14，15)，及顯著水平α=0.01，可由F分布臨界值表查得臨界的F值為3.56。F=3.14

2.4.2 穩(wěn)定性穩(wěn)定性是考察在特定時(shí)間間隔和貯存條件下，物質(zhì)的特性值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力。短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的溫度分別設(shè)為4、25、37 ℃，長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的溫度設(shè)為-20 ℃。每個(gè)溫度條件下貯存多支樣品，在不同時(shí)間取出3支樣品，按“1.6”方法重復(fù)測定3次。各貯存條件下的膠原含量檢測結(jié)果見圖6。對于穩(wěn)定性的檢測結(jié)果通過回歸曲線方法進(jìn)行判斷，穩(wěn)定性評估基本模型為：Y=β0+β1X。式中：β0、β1為回歸系數(shù)；X為時(shí)間；Y為物質(zhì)的特性值。

根據(jù)公式計(jì)算，4、25、37、-20 ℃下的斜率β1分別為-0.004、-0.007、-0.007和-0.004，截距β0分別為0.986、1.001、0.961和0.954，β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(β1)分別為0.005、0.013、0.013和0.012?；讦?的標(biāo)準(zhǔn)偏差，用t檢驗(yàn)檢測其顯著性，其中t0.95,1=12.7。在4、25、37、-20 ℃條件下，|β1|

2.4.3 定值利用本方法，聯(lián)合3家實(shí)驗(yàn)室對3支膠原海綿樣品進(jìn)行測定，以驗(yàn)證方法的可行性與準(zhǔn)確性，結(jié)果見表5。對該數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以判斷是否滿足定值要求并確定膠原海綿含量的標(biāo)準(zhǔn)值。首先采用t-檢驗(yàn)法和狄克遜(Dixon)法對每一組獨(dú)立檢測結(jié)果進(jìn)行組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)，剔除可疑值，結(jié)果所有值均保留。然后采用科克倫(Cochran)法檢驗(yàn)，先計(jì)算各組數(shù)據(jù)的方差，再計(jì)算其中最大方差與各組方差和之比，確保了各組數(shù)據(jù)的平均值均為等精度。隨后采用格拉布斯(Grubbs)法驗(yàn)證了各組數(shù)據(jù)平均值均無顯著性差異。最后采用夏皮洛-威爾克(Shapiro-Wilk)法檢驗(yàn)4組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。因此，求出的總平均值：牛Ⅰ型膠原含量=(0.926±0.014) mg/mg，為準(zhǔn)確值。

2.4.4 水分與灰分按照“1.7”方法測定膠原海綿產(chǎn)品的含水量為3.24%～4.05%，灰分含量為2.58%～5.32%。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種高靈敏的牛Ⅰ型膠原定性定量的方法，從特征多肽的篩選、HPLC-MS分析和數(shù)據(jù)處理等方面進(jìn)行了探討。以牛Ⅰ型膠原為研究對象，篩選序列中的特征肽為外標(biāo)，采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行定量檢測。在不同的加標(biāo)水平下，平均回收率為98.2%～102%，峰面積的RSD為0.80%，方法具有良好的回收率和精密度。依據(jù)國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[19]對該牛Ⅰ型膠原海綿產(chǎn)品的穩(wěn)定性、均勻性和定值進(jìn)行測定，確定該膠原海綿產(chǎn)品的牛Ⅰ型膠原含量為(0.926±0.014) mg/mg，證明了方法的可行性和準(zhǔn)確性，亦證實(shí)了該產(chǎn)品具有成為牛Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品的潛力。本文為不同類型膠原的定量分析提供了可靠準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。