孫秀鳳, 周芬, 吳婷

肺癌是一種發(fā)病率和死亡率極高的常見惡性腫瘤,目前已躍居我國腫瘤死因首位,多發(fā)于男性,其主要致病原因與吸煙、環(huán)境等密切相關[1-2]。肺癌根據其生物學特性和治療方法可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩種類型,其中NSCLC約占肺癌患者的90%[3]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長于200 bp的非編碼RNA,其在包括肺癌在內的多種腫瘤中異常表達[4-6]。microRNA可以調節(jié)基因轉錄效率,抑制目標信使RNA翻譯的起始和延伸,促進目標信使RNA衰變,降低從目標信使RNA合成的蛋白質的穩(wěn)定性等[7]。肺腺癌轉移相關轉錄物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)又稱為非編碼核內富集轉錄本1,是最早被證明與人類疾病相關的lncRNA之一。有研究顯示,MALAT1可參與調控NSCLC增殖、凋亡及侵襲等過程,但有關其作用機制尚存爭議[8-9]。本研究旨在探討lncRNA MALAT1對NSCLS增殖、侵襲遷移及凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要細胞及組織

肺癌A549細胞購自中國科學院細胞庫;34例NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織均來自2015年6月至2017年8月在天門市第一人民醫(yī)院接受肺癌手術的NSCLC患者,其中男17例,女17例;年齡29～70歲,平均(41.13±7.83)歲;體重39～82 kg,平均(61.28±8.59)kg;腫瘤直徑2.5～7.2 cm,平均(4.63±1.58)cm;TNM分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期7例,Ⅲ期11例,Ⅳ期10例。納入標準:符合2013年衛(wèi)生部臨床路徑專家委員組編寫的《原發(fā)性肺癌外科手術臨床路徑》中肺癌診斷標準,經病理學診斷確診為NSCLC患者;入院治療前未接受放療、化療、手術和靶向藥物等治療;術前均存在可測量病灶,臨床資料完整;無肺部感染和低蛋白血癥;無免疫系統(tǒng)疾病;無呼吸系統(tǒng)疾病;無腫瘤轉移或患有其他腫瘤;無先天性肺功能異?；蚧?簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

E-cadherin Ig1(1∶500,貨號sc-52327)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;兔抗增殖細胞周期相關核抗原(Ki67，1∶500,貨號201826123)、兔抗Caspase-9(1∶500,貨號201872169)和二抗羊抗鼠IgG二抗蛋白(貨號2018630258)購自武漢華聯(lián)科有限公司(代理公司);RPMI1640培養(yǎng)基購自廣州威佳科技有限公司;HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司;青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠;質粒購自豐暉生物;TRAIL購自英國Pepro Tech 公司;細胞轉染試劑盒購自賽默飛世爾科技公司;Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司;磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司。

HC-2068恒溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司;Leica DM6000 M光學顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司;MoFlo XDP流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司;Thermo forma3111細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司;Trans-Blot Turbo蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)、分組與轉染 將肺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),取對數生長期細胞進行實驗。將肺癌A549細胞分為Control組、shRNA-NC組和sh-MALAT1組;其中shRNA-NC組使用空白質粒轉染,sh-MALAT1組利用干擾RNA(siRNA)敲除lncRNA MALAT1并轉染肺癌A549細胞(由豐暉生物完成),嚴格按照轉染試劑盒說明書方法操作;空白對照組不做任何轉染處理。轉染 48 h 后,收集細胞,進行后續(xù)實驗。

1.3.2 實時定量PCR(RT-PCR)檢測MALAT1的表達 根據在NCBI中查到RNA MALAT1的核酸序列設計引物。將肺癌A549細胞研磨,用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA,采用蛋白核酸分析儀測定RNA濃度和純度后,用反轉錄試劑盒反轉錄RNA得cDNA,以該cDNA為模板,按照試劑盒說明書進行RT-PCR實驗。反應條件,95 ℃預變性5 min,90 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán),72 ℃延伸5 min,以β-actin為內參,各引物的序列見表1,采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.3 克隆形成實驗 取對數生長期的肺癌A549細胞,制作1×105/ml單細胞懸液并計數,將細胞接種到6孔板中分細胞梯度培養(yǎng)(以每孔50個、100個、200個的細胞梯度),2周后光學顯微鏡下可見明顯克隆形成,加入結晶紫染液染色30 min后拍照,并計算克隆形成率=克隆數/所種細胞數×100%。

1.3.4 采用流式細胞儀檢測肺癌A549細胞凋亡率 取對數生長期細胞,使用恒溫離心機保持4 ℃,離心 5 min收集細胞;收集細胞后加入100 μl Binding Buffer 重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,輕輕混勻;室溫避光孵育15 min并加入400 μl Binding Buffer 使用流式細胞儀檢測肺癌A549細胞凋亡情況。

1.3.5 采用Transwell檢測肺癌A549細胞侵襲能力 取對數生長期肺癌A549細胞,調節(jié)細胞密度為1×105個/ml,使用RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),小室下層加入正常培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后用無菌棉簽擦去小室內細胞,加入結晶紫,對侵襲至小室下層的細胞進行染色30 min后觀察,每孔隨機選取5個視野進行計數統(tǒng)計,每組3個復孔,實驗至少重復3次。

1.3.6 Western blot檢測Ki67、Caspase-9、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)蛋白表達水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白,半干法將蛋白轉移到PVDF膜,置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白,孵育2 h,TBS洗凈,蛋白表達定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析,以β-actin為內參蛋白,將檢測蛋白的灰度帶入標準內參的灰度標準曲線計算各蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 肺癌組織與癌旁正常組織中MALAT1表達情況

肺癌組織與癌旁正常組織中MALAT1表達水平分別為4.35±1.29、2.01±1.02,肺癌組織中MALAT1表達水平顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.296,P<0.001)。

2.2 lncRNA MALAT1對NSCLS增殖的影響

shRNA-NC組MALAT1表達水平、細胞克隆形成率和Ki67蛋白表達水平與Control組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),sh-MALAT1組MALAT1表達水平、細胞克隆形成率和Ki67蛋白表達水平均顯著低于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),見圖1。

2.3 lncRNA MALAT1對NSCLS凋亡的影響

shRNA-NC組細胞凋亡率、Caspase-9蛋白表達水平與Control組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);sh-MALAT1組細胞凋亡率、Caspase-9蛋白表達水平均顯著高于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),見圖2。

2.4 lncRNA MALAT1對NSCLS侵襲、遷移的影響

shRNA-NC組單位面積細胞侵襲數目、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達與Control組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);sh-MALAT1組單位面積細胞侵襲數目和N-cadherin蛋白表達顯著低于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),E-cadherin蛋白表達水平顯著高于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),見圖3。

注:1A為MALAT1基因表達情況;1B為細胞克隆形成實驗(×1);1C為Ki67蛋白表達情況;a與Control組比較,P<0.05;b與shRNA-NC組比較,P<0.05圖1 lncRNA MALAT1對NSCLS增殖的影響

注:2A為細胞凋亡情況;2B為Caspase-9蛋白表達情況;a與Control組比較,P<0.05;b與shRNA-NC組比較,P<0.05圖2 lncRNA MALAT1對NSCLS凋亡的影響

3 討論

MALAT1又稱為肺腺癌轉移相關轉錄本1,是由染色體11q13轉錄而來,長度約為8.7 kbp的長鏈非編碼RNA[10]。石婷等[11]研究表明,生理應激或癌基因的激活會促進MALAT1的表達水平升高。高度保守的lncRNA MALAT1的失調與頸腫瘤、肺腫瘤相關[12-13]。本研究結果顯示,肺癌患者組織中MALAT1表達水平顯著高于癌旁正常組織,與王俊鋼等[14]研究結果一致。Ki67所編碼的基因位于10號染色體上,其分子量為345 kd,是一種細胞核內與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原,其是反映細胞增殖的敏感指標,同時這種基因在維持細胞結構方面起著重要作用。馬志君等[15]研究表明:Ki67的表達與細胞增殖密切相關,是調節(jié)細胞周期的重要組成部分。本研究結果顯示,sh-MALAT1組細胞克隆形成率及Ki67蛋白表達水平顯著低于Control組和shRNA-NC組,提示sh-MALAT1組肺癌A549細胞增殖受到了顯著地抑制,這可能是由于MALAT1通過抑制Ki67的表達,調節(jié)細胞周期,使得A549細胞增殖受到抑制。

注:3A為Transwell小室實驗(×400);3B為侵襲相關蛋白表達情況;a與Control組比較,P<0.05;b與shRNA-NC組比較,P<0.05圖3 長鏈非編碼RNA MALAT1對NSCLS侵襲、遷移影響

調控癌細胞不僅要抑制其增殖,促進其凋亡也是重要手段之一。其中Caspase是細胞凋亡的核心,Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子。賈曉鵬等[16]通過前列腺腺癌細胞實驗分析得出:Caspase-9基因處于Caspase家族激活基因的頂端,是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子,通過自身的裂解使得proCaspase-3產生有活性的Caspase-3。這種有活性的Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因,主要作用機理是通過剪切另外的Caspase底物引起級聯(lián)反應,最終導致細胞凋亡。本研究結果顯示,與shRNA-NC組相比,sh-MALAT1組細胞Caspase-9蛋白表達水平及細胞凋亡率均顯著升高,提示降低MALAT1的表達可以通過調控細胞凋亡因子的水平促進細胞的凋亡。肖宜等[17]研究表明:升高MALAT1的表達水平可以促進凋亡因子的表達,有效促癌細胞的凋亡,與本研究得出的結論相一致。

E-cadherin是黏附分子蛋白家族的一員,E-cadherin表達下調會使間質細胞標志物如波形蛋白(Vimentin)、纖聯(lián)蛋白(fironcetion)等表達上調,誘導上皮間質轉化的細胞因子、轉錄因子及輔助作用的一些酶等均表達上調[18]。蒲金定等[19]研究表明:癌細胞中最重要的標志性變化就是E-cadherin的減少或丟失。N-cadherin也被稱為鈣黏著蛋白-2(CDH2)或神經鈣黏著蛋白(NCAD),是人體由CDH2基因編碼的蛋白質。N-cadherin是在多種組織中表達并起到介導細胞-細胞黏附功能的跨膜蛋白。本研究結果顯示,與shRNA-NC組相比,sh-MALAT1組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高,N-cadherin蛋白表達水平顯著降低,提示降低MALAT1的表達可以通過上皮間質轉化過程改變NSCLC細胞的運動能力。劉速等[20]研究表明,lncRNA MALAT1可以有效抑制癌細胞的侵襲遷移及運動能力,與本研究得出的結論相一致。

綜上所述lncRNA MALAT1在肺癌組織中過表達,敲低NSCLC細胞中MALAT1的表達水平可以抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲及遷移并促進NSCLC細胞的凋亡,其作用機制可能與調控細胞增殖及凋亡相關蛋白表達相關,同時lncRNA MALAT1可以通過調控上皮間質轉化過程抑制癌細胞的運動能力。在后續(xù)的實驗中將通過小鼠體內實驗進一步探討MALAT1在小鼠體內的表達對肺癌的影響。