王心意，鞠建慶，田園碩，樊懿萱，徐 浩

據(jù)《中國心血管報告2018》統(tǒng)計，以冠心病和腦卒中為代表的動脈硬化性心血管疾病(ASCVD)死亡人數(shù)占我國居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，居各病因之首，以血管壁功能紊亂和粥樣斑塊為特征的動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是ASCVD的病理基礎(chǔ)[1]。中醫(yī)藥在防治AS中發(fā)揮著重要作用，其中清熱活血中藥赤芍(Paeoniae Rubra Radix)是具有抗AS作用的代表藥物之一。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根。其味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》記載：“化瘀血，赤者較優(yōu)……為其能化毒熱之瘀血不使?jié)⒛撘病盵2]?，F(xiàn)代研究表明，赤芍具有抗凝、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗內(nèi)毒素等多種藥理學(xué)作用[3]。動物實驗表明，赤芍對家兔實驗性AS病灶具有明顯的消退作用[4]。然而，其抗AS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新興的藥物研究模式，從整體角度探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，強調(diào)從“單靶標(biāo)”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”研究模式轉(zhuǎn)變[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對赤芍治療AS的活性成分和其信號通路進行預(yù)測分析，為進一步臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 赤芍活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[6]，以“chishao”為關(guān)鍵詞檢索赤芍中的化學(xué)成分，篩選出赤芍化合物中符合口服生物利用度 (OB)[7]≥30%和生物活性分子的類藥性(DL)[8]≥0.18的化學(xué)成分作為活性成分。同樣基于 TCMSP 平臺，通過檢索獲得赤芍中活性成分所作用的靶標(biāo)。

1.2 疾病靶點的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)，以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞檢索已報道的與AS相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因和假陽性基因。將獲得的基因與赤芍有效成分作用的靶標(biāo)進行比對取交集，得到赤芍治療AS的作用靶點用于后續(xù)的研究。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了進一步了解赤芍靶點和疾病靶點在蛋白水平上的作用機制，以STRING平臺(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)[9-10]，獲取蛋白互作關(guān)系。其中，物種設(shè)為“homo sapiens”(人類)，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度0.4“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認設(shè)置。以網(wǎng)絡(luò)中的各靶基因的“節(jié)點連接度(Degree)”為指標(biāo)，通過 Degree的測算篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白質(zhì)靶標(biāo)。

1.4 作用靶點類型歸屬 DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)是包含與人類疾病相關(guān)的基因和變體最完整的數(shù)據(jù)庫之一，可通過輸入基因獲得與該基因相關(guān)的疾病信息[11]。在該數(shù)據(jù)庫中選擇基因進行檢索，依次輸入赤芍治療AS的作用靶點，獲取作用靶點類型。

1.5 赤芍-活性成分-抗AS作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選之后赤芍治療AS的有效活性成分和作用靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建赤芍-活性成分-抗AS作用靶點網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個節(jié)點(node)是基因、蛋白質(zhì)或分子，節(jié)點與節(jié)點之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點的度值(degree)代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點與節(jié)點相連的數(shù)目，度值越大，這個靶點越有可能成為化合物的關(guān)鍵作用靶點。

1.6 基因本體論(gene ontology，GO)和KEGG富集分析 將赤芍治療AS的靶基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org)進行基因富集分析。Metascape是一種有效且高效的工具，旨在提供全面的基因列表注釋和分析資源[12]。以P<0.01作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的篩選條件，設(shè)置min overlap=3，Min Enrichment=1.5，對獲取的靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 赤芍活性成分篩選及候選化合物靶點預(yù)測 經(jīng)過TCMSP平臺檢索，獲得赤芍的化合物119個。設(shè)定OB≥30% 和 DL≥0.18，篩選出活性化合物29個，基本信息見表1。將這些活性化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺逐一進行比對，得到了這些活性化合物作用的靶點共41個。

表1 赤芍中29個活性化合物的基本信息

2.2 AS疾病靶點收集 基于GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫共收集AS相關(guān)靶點基因，挖掘并刪除重復(fù)靶點，共收集到AS疾病相關(guān)靶點3 812個。將上述篩選出來的中藥中具有潛在作用的靶點基因和疾病靶點基因進行匹配映射并在線繪制韋恩圖，獲得共同靶點基因36個。詳見圖1。

圖1 赤芍活性成分-抗AS作用靶點韋恩圖

2.3 赤芍靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將屬于赤芍的36個靶點在STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，見圖2。并將得到的交集靶點信息進行基因名和Uniprot ID的標(biāo)準(zhǔn)化，具體信息見表2。圖2包含36個節(jié)點(其中隱藏2個游離節(jié)點)、157條邊，平均Degree為8.72。分別計算網(wǎng)絡(luò)圖中每個靶點的Degree，采用R包“ggplot2”繪制了Degree最大的前30個靶點的柱狀圖，見圖3。得到14個重要的AS相關(guān)蛋白質(zhì)靶點，分別為IL6、ESR1、VEGFA、FOS、CASP3、AR、RELA、CYCS、PGR、HIF1A、CASP8、CASP9、AHR、CCNB1等基因(Degree≥10)。

圖2 AS與赤芍共有PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 赤芍抗AS作用靶點

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點

2.4 作用靶點類型歸屬 將34個作用靶點依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)的蛋白類型，見表3。結(jié)果表明，赤芍治療AS過程中涉及信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、酶(氧化還原酶、水解酶、蛋白酶、激酶、轉(zhuǎn)移酶)、酶調(diào)節(jié)劑、受體等物質(zhì)。

表3 赤芍活性成分治療AS作用靶點分類

2.5 中藥-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.1軟件建立赤芍-活性成分-抗AS靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。共有50個節(jié)點(1個疾病節(jié)點，1個藥物節(jié)點，12個化合物節(jié)點、36個基因節(jié)點)和113條邊，其中12個綠色節(jié)點代表了赤芍的活性成分，36個藍色節(jié)點代表了抗AS靶點，113條邊代表了化學(xué)成分與AS靶點的相互作用。該網(wǎng)絡(luò)中，每個化合物平均與5.42個靶點相互作用，每個靶點平均與1.81個化合物相互作用，因此，赤芍的活性成分中存在1個化合物與多個靶點之間的相互作用，同時也存在不同化合物共同作用于同一個靶點的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點之間共同作用的機制。結(jié)果表明，赤芍的29個潛在活性成分中，與作用靶點直接相連的成分有12個，為赤芍治療AS的活性成分。包括黃芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、(+)-兒茶素、Spinasterol、谷甾醇、(2R，3R)-4-methoxyl-distylin、campest-5-en-3beta-ol、油酸乙酯、stigmast-7-en-3-ol、芍藥苷。

圖4 赤芍-活性成分-抗AS靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO和KEGG富集分析 Metascape中GO功能富集分析得到 GO 條目146個(P<0.05)，其中生物過程(biological process，BP)條目73個，分子功能(cellular component，CC)條目15個，細胞組成(molecular function，MF)相關(guān)的條目58個。詳見圖5。GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要包括對類固醇激素的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)、細胞對激素刺激的反應(yīng)；細胞成分主要包括核染色質(zhì)、核染色體部分、核染色體、染色質(zhì)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、細胞溶質(zhì)部分突觸前膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、參與凋亡信號通路的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等，涉及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。KEGG信號通路富集中靶點數(shù)量前20的信號通路主要包括細胞凋亡、白介素-17(IL-17)信號通路、流體剪切應(yīng)力(FSS)與AS、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、Toll樣受體(TLR4)信號通路、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號通路等。詳見圖6。

圖5 赤芍抗AS靶點的GO分析

圖6 赤芍靶點的KEGG通路富集分析

3 討 論

根據(jù)專家共識，AS的主要證候包括痰瘀互結(jié)證、氣陰兩虛證、氣虛血瘀證和氣滯血瘀證[13]。赤芍具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效，是治療AS有潛力的藥物。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，有助于系統(tǒng)全面闡釋赤芍治療AS的作用機制，為臨床治療AS提供新的思路。

本研究通過構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)得到赤芍中12個活性成分，且部分成分的有效性已被證實。有研究表明，芍藥苷抑制β抑制蛋白2抗體的表達，改善G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過度脫敏，從而降低炎癥因子水平[14]。黃芩素可以明顯降低組織中丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，從而降低高脂血癥性脂肪肝大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平[15]。此外，黃芩素可以通過降低氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)對心肌細胞起到保護作用[16]。β-谷甾醇可降低高血脂大鼠血清TC、TG，抑制脂質(zhì)過氧化，起到預(yù)防AS的作用[17]。鞣花酸通過對氧磷酸內(nèi)酯酶防止低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過氧化及抑制高脂飲食大鼠的攝食量，防止AS[18-19]。豆甾醇具有強大的抗氧化、降血脂、抗炎、抗腫瘤、降血糖及甲狀腺抑制等作用[20]。兒茶素可以抗AS，與其降脂、抗氧化有關(guān)[21]。本研究通過匹配中藥靶點與疾病靶點，獲得赤芍治療AS的36個靶點基因。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，Degree≥10的節(jié)點包括IL6、ESR1、VEGFA、FOS、CASP3、AR、RELA、CYCS、PGR、HIF1A、CASP8、CASP9、AHR、CCNB1。動物實驗表明，IL6促進早期AS病變的發(fā)展[22]。ESR1是雌激素對脈管系統(tǒng)的AS具有保護作用的重要介質(zhì)。一項回顧性研究提示，ESR1基因變異可能與AS風(fēng)險增高有關(guān)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠AS斑塊中血管VEGFA表達與新血管形成顯著減少有關(guān)，提示VEGFA具有抗AS作用[24]。FOS基因被認為是AS進展和嚴重程度的因素之一，且新發(fā)現(xiàn)認為其是冠狀動脈疾病中煙草發(fā)揮毒性的新途徑[25]。Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9是凋亡蛋白酶，在AS斑塊中表達[26]。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)AR在相對早期AS中占有重要地位，而減少AR的表達與更廣泛的AS相關(guān)。Akhta等[28]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)通過觸發(fā)miR-19a介導(dǎo)的CXCL1表達和單核細胞黏附促進AS，并提出抑制內(nèi)皮HIF-1α/miR-19a途徑可能是抗AS的治療選擇。Wu等[29]研究表明，AHR的激活可以誘導(dǎo)血管炎癥并促進Apo-E小鼠AS形成。RELA、CYCS、PGR、CCNB1等與AS的相關(guān)性研究尚少。

富集分析和靶點歸屬分析結(jié)果表明，赤芍抗AS涉及細胞過程、代謝過程等多個生物過程，有信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、蛋白和酶、酶調(diào)節(jié)劑、受體等多種物質(zhì)參與，過程較復(fù)雜。KEGG分析顯示以上成分作用的靶標(biāo)顯著富集于細胞凋亡、IL-17信號通路、FSS與AS、HIF-1信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、TLR4信號通路、PI3K-Akt信號通路等多個通路。目前有較多證據(jù)表明，細胞凋亡，尤其是巨噬細胞凋亡，發(fā)生在AS的各個階段[30]。有研究證實，選擇性抑制PI3K-Akt信號通路能誘導(dǎo)巨噬細胞自噬，減少斑塊巨噬細胞的浸潤，抑制炎癥反應(yīng)從而穩(wěn)定AS易損斑塊[31]。而PI3K-Akt能直接或間接地影響p53等抑癌基因的表達從而調(diào)控細胞存活[32]。Th17由CD4T淋巴細胞分化而來，主要分泌IL-17。隨著AS方面研究的深入，IL-17和Th17都被發(fā)現(xiàn)與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但二者在疾病發(fā)展和斑塊穩(wěn)定性中作用的結(jié)果尚無一致定論[33-34]。既往認為白細胞介素-17A(IL-17A)會促AS形成[35]。但近年來有研究得出相反的結(jié)論，認為IL-17A表達缺陷可促進粥樣斑塊進展[36]。FSS由于其脈動的性質(zhì)和血液流動，其數(shù)值并不穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)頻率諧波的劇烈變化可促使AS的發(fā)生，表明內(nèi)皮細胞能夠感知和響應(yīng)FSS的變化[37]。HIF-1是異二聚體蛋白，是低氧環(huán)境中細胞反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子之一，通過作用于內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞的細胞特異性反應(yīng)在AS的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。有研究提出通過HIF-1表達/活化的信號通路可以對治療AS發(fā)揮巨大作用[38]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種炎癥標(biāo)志物，由單核巨噬細胞分泌。有研究表明，TNF-α能通過刺激血管平滑肌細胞的遷移，促進內(nèi)皮細胞表達黏附因子、炎癥因子，促進AS的發(fā)生與發(fā)展[39-40]。馬淑慧[41]通過分子機制研究，發(fā)現(xiàn)赤芍主要成分芍藥苷對血管內(nèi)皮細胞腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的介導(dǎo)信號的抑制作用是赤芍發(fā)揮活血化瘀、抗AS的重要作用機制之一，這個發(fā)現(xiàn)與本研究得出的結(jié)果也一致。目前甲狀腺激素與AS相關(guān)性尚未明確，相關(guān)研究提示，促甲狀腺激素可能是AS的獨立危險因素[42]。Michelsen等[43]證實了TLR4的遺傳缺陷與ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積減少有關(guān)，表明TLR4信號傳導(dǎo)與AS有密切聯(lián)系。

4 小 結(jié)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析赤芍抗AS的作用機制，赤芍通過調(diào)控相應(yīng)的細胞凋亡、IL-17信號通路、FSS與AS、HIF-1信號通路等發(fā)揮治療作用。本研究相關(guān)通路的分析與文獻報道基本一致，表明活性成分與靶點的可靠性。因此，赤芍中12個活性成分通過調(diào)控34個靶點，共同發(fā)揮抗AS的作用，體現(xiàn)了赤芍多成分、多靶點、多途徑治療的特點，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法也體現(xiàn)了中醫(yī)藥的整體觀與系統(tǒng)性，為中醫(yī)藥治療多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病提供了新的途徑。