鄭海武,雷蕾,李正英,趙雪平,張美枝,李婷,黃海英,李曉娟,王春燕

(內蒙古農(nóng)業(yè)大學 職業(yè)技術學院，內蒙古 包頭，014100)

我國是世界葡萄酒消費增長速度最快的國家，人均葡萄酒消費量居世界前列[1]。中國已經(jīng)逐漸成為葡萄酒生產(chǎn)和消費大國[2]。葡萄酒的釀造關鍵在于葡萄原料、工藝及發(fā)酵菌株，我國具有多個優(yōu)良的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)及成熟的發(fā)酵釀造工藝，目前我國葡萄酒釀造多采用進口菌株，提高了釀造成本，降低了本土葡萄酒特色。我國的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)具有多樣性，葡萄種植歷史同樣比較悠久，為我國野生酵母篩選提供了寶貴的自然菌種庫，挖掘本土特色釀酒酵母具有一定的研究意義。

在葡萄酒釀造中，發(fā)酵酵母應當具備優(yōu)良的釀造學特性，嗜殺性反應其抵抗外界攻擊保真發(fā)酵正常進行的能力[3-4]，產(chǎn)硫化氫特性是酵母發(fā)酵過程產(chǎn)硫化氫多少的能力，硫化氫具有不良風味影響葡萄酒感官品質[5]，產(chǎn)泡性是酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量的多少，產(chǎn)氣過多導致皮渣上浮、溢罐、爆罐等問題。絮凝性是酵母黏附成團沉降的特性，酵母沉降在發(fā)酵后期有利于酒的澄清及后發(fā)酵的管理[6-7]。模擬發(fā)酵系性能是酵母能夠發(fā)酵酒的基本釀造學測定。課題組從全國多個釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)進行采樣篩選釀酒酵母菌，得到106株酵母菌，通過起酵速度、發(fā)酵速度、耐酒精能力、耐SO2、耐高糖等試驗優(yōu)選得到4株優(yōu)良釀酒酵母[8]。本實驗通過對4株本土篩選釀酒酵母菌與商業(yè)釀酒酵母菌進行釀造學特性研究對照，以期挖掘出能夠滿足優(yōu)良酵母菌釀造學特性的釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

S12酵母菌,從種植于山東高密的梅鹿輒葡萄果實上分離；S21酵母菌，從種植于山東平度的京亞葡萄果實上分離；Q12酵母菌，從種植于山東平度的早霞玫瑰葡萄果實上分離；WJ1酵母菌，從內蒙古烏海農(nóng)家的發(fā)酵醪液中分離，由內蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院食品系菌種庫提供。

對照菌株為法國諾蒙集團XR (Excellence XR)及DS(Excellence DS)，安琪酵母股份有限公司CECA及CEC01。敏感菌株S.cerevisiae1296，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司。

1.1.2 試劑配制

YEPD-MB培養(yǎng)基(g/L)： 葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，亞甲基藍0.03，瓊脂20。

檸檬酸磷酸鹽緩沖液：0.1 mol/L 檸檬酸9.6 mL，0.2 mol/L Na2HPO40.4 mL；

去絮凝緩沖溶液：50 mmol/L檸檬酸鈉，5 mmol/L EDTA，pH 3.0；

絮凝緩沖液：50 mmol/L檸檬酸鈉，20 mmol/L CaCl2，0.1 mol/L pH 2.2檸檬酸。

1.1.3 儀器與設備

STARTER3100精密pH計， 奧豪斯儀器有限公司；SA2202S-CW電子天平， 德國賽多利斯；TU1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析儀器廠；DK-8IIA數(shù)顯恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；DL-1電熱爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；VD-1320超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司北京分公司；SX-700立式壓力蒸汽滅菌鍋，北京世貿遠東科學儀器有限公司；KS4000ic 控制型搖床培養(yǎng)箱，德國IKA儀器設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒酵母菌株的嗜殺性特性對照

將唐瑩瑩[8]篩選得到的4株優(yōu)良發(fā)酵特性的本土釀酒酵母S12、S21、WJ1、Q12與4株商業(yè)釀酒酵母XR、DS、CEC01、CECA分別制成菌懸液,無菌環(huán)境操作,吸取200 μL菌懸液接種到10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。同等條件活化傳至3代。將敏感菌株S.cerevisiae1296菌粉置于5 mL YPD液體培養(yǎng)基試管中，在28 ℃培養(yǎng)箱內活化48 h，然后用生理鹽水稀釋至107CFU/mL，稀釋的敏感菌株S.cerevisiae1296涂布于YEPD-MB培養(yǎng)基上，采用牛津杯抑菌法，以4株本土優(yōu)良酵母與4株商業(yè)酵母作為抑菌劑在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察并測定酵母菌株周圍藍色的死菌帶，測定抑菌圈(包括菌落)直徑與菌落直徑的差值表示抑菌圈大小[9]。

1.2.2 本土釀酒酵母菌株的產(chǎn)硫化氫試驗

將唐瑩瑩[8]篩選得到的4株優(yōu)良發(fā)酵特性的本土釀酒酵母S12、S21、WJ1、Q12與4株商業(yè)釀酒酵母XR、DS、CEC01、CECA分別制成菌懸液，無菌環(huán)境操作，吸取200 μL菌懸液接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。同等條件活化傳至3代。將活化后的菌液點樣于BIGGY培養(yǎng)基上，將接種后的BIGGY培養(yǎng)皿置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察菌落顏色。

1.2.3 本土釀酒酵母產(chǎn)泡性

將唐瑩瑩[8]篩選得到的4株優(yōu)良發(fā)酵特性的本土釀酒酵母S12、S21、WJ1、Q12與4株商業(yè)釀酒酵母XR、DS、CEC01、CECA分別制成菌懸液,無菌環(huán)境操作,吸取200 μL菌懸液接種10 mL YPD液體培養(yǎng)基中, 28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。同等條件活化傳至3代。采用平板計數(shù)法，計算菌液濃度后，將菌液濃度稀釋至5×106CFU/mL，取稀后的菌懸液200 μL接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24 h。每4 h測量1次泡沫高度，記錄24 h內產(chǎn)泡沫最高高度[10]。

1.2.4 本土釀酒酵母絮凝特性

參照BONY等[11]的方法并稍作修改。將生長中期的4株本土釀酒酵母和4株商業(yè)釀酒酵母的菌液，分別用去絮凝緩沖液和無菌水洗滌2遍，置于絮凝緩沖液中，于600 nm處測定其吸光值(A)。將絮凝緩沖液置于50 mL三角瓶中，在30 ℃培養(yǎng)箱中(100 r/min)振蕩培養(yǎng)2 h。取5 mL細胞懸浮液置于10 mL試管中，靜置30 min，從凹液下準確吸取350 μL液體，于600 nm處測量吸光值(B)，試驗平行3次。絮凝值flocculation value，F(xiàn)lo計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Flo，絮凝值;A，在搖瓶前懸浮于絮凝緩沖液中的細胞吸光度；B，細胞絮凝沉降后的吸光度。當Flo在70%～100%時，屬于低絮凝性；當Flo在30%～70%時，屬于中絮凝性；當Flo在0%～30%時，屬于高絮凝性。

1.2.5 本土釀酒酵母模擬發(fā)酵性能測定

將4株本土釀酒酵母和4株商用釀酒酵母用于模擬發(fā)酵試驗。模擬葡萄汁中葡萄糖含量為100 g/L，果糖100 g/L，總酸3.0 g/L,酒石酸調節(jié)pH值至5.8，將其微溫溶解后，過濾殺菌。在發(fā)酵結束后，參照GB/T 15038—2006測定發(fā)酵液中的總酸、還原糖、酒精度及pH。

1.2.6 發(fā)酵梅廘輒干紅葡萄酒感官品評

通過發(fā)酵性能基本測定篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的本土釀酒酵母與3株對照菌種分別進行發(fā)酵梅鹿輒實驗，發(fā)酵結束由2位國家二級果露酒品評師、4位國家三級果露酒品評師、1位資深釀酒師組成品評團進行品評，去除1個最高分去除1個最低分，得到平均分，然后對菌種進行評價。

2 結果與分析

2.1 本土釀酒酵母菌株的嗜殺性

釀酒酵母的嗜殺性是指對外界微生物攻擊具有防御能力，嗜殺性越強，代表釀酒酵母菌株對外界微生物抵御能力及抗干擾能力越強，越能更好地保障葡萄酒順利完成發(fā)酵[12]。嗜殺酵母是指在某些酵母生長和繁殖過程中，能殺死或抑制某些毒素蛋白，無論是否與敏感菌株同源[13]。這種毒素蛋白被稱為嗜殺毒素，嗜殺酵母對其自身分泌的嗜殺毒素具有免疫力[14]。由圖1可知，4株本土釀酒酵母與4株商業(yè)釀酒酵母的抑菌圈均具有顯著的嗜殺性。商業(yè)釀酒酵母抑菌圈為5.60～7.66 mm，本土釀酒酵母抑菌圈為5.13～7.35 mm。本土篩選酵母WJ1嗜殺性顯著低于商業(yè)酵母CECA，高于CEC01、XR、DS，Q12嗜殺性顯著低于商業(yè)酵母XR、CECA、CEC01，與商業(yè)酵母DS較為接近且差異不顯著，S1、S2其嗜殺性均高于商業(yè)酵母DS，低于商業(yè)酵母XR、CECA、CEC01且差異顯著，因此4株本土篩選酵母均達到了商業(yè)酵母菌的嗜殺性，具有開發(fā)商業(yè)酵母的潛質。

圖1 酵母嗜殺性抑菌圈Fig.1 Yeast killer inhibitory zone

2.2 本土釀酒酵母菌株的產(chǎn)硫化氫性能

硫化氫能夠與鉍結合生成黑色硫化鉍沉淀，以鉍為指示劑根據(jù)選擇性培養(yǎng)基BIGGY顏色深度判斷不同酵母菌株產(chǎn)硫化氫能力。接種于培養(yǎng)基的菌落顏色有6類，從低產(chǎn)到高產(chǎn)分別是白色、淺棕褐色、棕褐色、淺褐色、褐色和黑色。按顏色分為4個等級，其中白色菌落為不產(chǎn)硫化氫菌株，淺棕褐色為低產(chǎn)菌株，棕褐色和淺褐色為中產(chǎn)菌株，褐色和黑色為高產(chǎn)菌株[15]。由表1可知，4株商用釀酒酵母均為低產(chǎn)硫化氫菌株，本土釀酒酵母WJ1、Q12、S21為中產(chǎn)硫化氫菌株；S12為高產(chǎn)菌株；本土釀酒酵母產(chǎn)硫化氫性均高于商業(yè)釀酒酵母。硫化氫屬于揮發(fā)性物質，中少量硫化氫可通過后期澄清倒罐等管理減少其在酒中含量，而高產(chǎn)菌株S12導致葡萄酒中其含量偏高，使葡萄酒產(chǎn)生不愉快的味道，例如臭雞蛋味、大蒜味、香蔥味等。因此WJ1、Q12、S21具有一定釀造學特性，S12釀造學特性不佳。

表1 本土釀酒酵母菌株的產(chǎn)硫化氫性能Table 1 Hydrogen sulfide production of native Saccharomyces cerevisiae strains

2.3 本土釀酒酵母菌株的產(chǎn)泡沫性

在葡萄酒發(fā)酵過程中，產(chǎn)泡沫性太強很容易導致發(fā)酵罐“冒罐”甚至爆瓶。因此在選擇發(fā)酵菌株時，選擇產(chǎn)泡沫性較低的釀酒酵母有利于發(fā)酵的進行。試管中泡沫高度分為4個等級：不產(chǎn)泡、低產(chǎn)泡(泡沫高度<2 mm)、中產(chǎn)泡(泡沫高度2～4 mm)和高產(chǎn)泡(泡沫高度>4 mm)[10]。由表2可知， 4株商業(yè)釀酒酵母均為低產(chǎn)泡沫性菌株，最大泡沫高度為1.12～1.60 mm，本土釀酒酵母中有3株低產(chǎn)泡沫菌株，最大泡沫高度在1.78～1.89 mm，其產(chǎn)泡沫性能與4株商業(yè)酵母菌屬于同一等級，但顯著高于商業(yè)菌產(chǎn)泡性。而本土釀酒酵母S21為中產(chǎn)泡沫性菌株，泡沫高度為2.15 mm。 4株本土酵母均在可接受氣泡范圍內，果酒釀造過程中的泡沫可通過攪拌、通入空氣降低入罐量等措施進行減少或消除、來保證發(fā)酵的正常進行。

表2 本土釀酒酵母菌株的產(chǎn)泡沫性Table 2 Study on foaming of native Saccharomyces cerevisiae strains

2.4 本土釀酒酵母菌株的絮凝性

絮凝性是酵母黏附成團最終沉降的特性。良好的絮凝性有利于果酒的澄清及后期管理[16]。因此酵母絮凝性是果酒釀造學特性的重要指標。由表3可知，4株商業(yè)釀酒酵母的絮凝值在22.24%～28.71%，屬于高絮凝菌株；本土釀酒酵母WJ1、S12絮凝值在26.34%～26.75%，絮凝值與商業(yè)釀酒酵母相似，屬于高絮凝菌株；Q12、S21絮凝值在43.81%～61.55%，屬于中絮凝性菌株，中絮凝菌株可通過增加澄清次數(shù)或添加澄清劑滿足后期管理要求。

表3 本土釀酒酵母菌株的絮凝性Table 3 Study on flocculation of native Saccharomyces cerevisiae strains

注：表中不同小寫字母表示顯著(P<0.05)(下同)

2.5 模擬發(fā)酵性能檢測

由表4可知，4株本土釀酒酵母的酒精度在10%vol～11%vol， 4株商業(yè)釀酒酵母酒精度10.5%vol～11%vol，S21酒精度為10%vol,顯著低于其他菌株，而其他3株本土釀酒酵母與商業(yè)釀酒均差異不顯著，說明3株本土釀酒酵母和商業(yè)釀酒酵母產(chǎn)酒精能力基本相同。

表4 本土釀酒酵母模擬葡萄汁發(fā)酵試驗Table 4 Native Saccharomyces cerevisiae simulated grape juice fermentation test

本土釀酒酵母WJ1和Q12發(fā)酵液的殘?zhí)橇繛?.46～0.53 g/L，與商業(yè)菌株殘?zhí)橇肯嗨疲琒21菌株發(fā)酵液殘?zhí)呛繛?.27 g/L，高于商業(yè)菌發(fā)酵液的殘?zhí)橇浚芯臧l(fā)酵液殘?zhí)呛烤? g/L，符合葡萄酒國標干型葡萄酒的標準(GB/T15037—2006)。

WJ1和Q12發(fā)酵液中總酸含量均滿足國家葡萄酒質量檢測標準總酸含量規(guī)定(5～7.5 g/L)[10],和4株商業(yè)釀酒酵母總酸含量(5.03～6.68 g/L)無太大差別。S21總酸含量為11.27 g/L，說明其產(chǎn)酸能力顯著高于對照菌種且其降酸能力較弱，總酸含量過高，在葡萄酒中如果酸性太強,會抑制葡萄酒的氧化反應及微生物的活性,酸性太強的葡萄酒會賦予葡萄酒尖酸、僵硬以及不愉快的味覺感受,對葡萄酒的品質和口感造成影響[17]。

干紅葡萄酒酒精發(fā)酵持續(xù)時間一般為7～15 d[19]，4株商業(yè)釀酒酵母菌的發(fā)酵時間為14～16 d，本土釀酒酵母WJ1和Q12的發(fā)酵時間分別為14和16 d，與對照菌株相當，本土釀酒酵母S21的發(fā)酵時間為28 d。發(fā)酵時間太長酒精會抑制微生物生長，導致發(fā)酵不徹底，原料浸泡時間太長會影響葡萄酒風味[20]。結合總酸和發(fā)酵時間的影響，S21不作為優(yōu)勢釀酒酵母進行葡萄汁發(fā)酵試驗。

2.6 菌種感官評定

如表5所示，本土釀酒酵母WJ1發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒品評人員平均得分78分，色澤與梅鹿輒葡萄酒色澤相近，略透明，具典型果香、酒香但略微不足，酸澀感較重，口感不夠柔順。酒體結構感一般；Q12平均得分最低為68分，顏色與典型梅鹿輒葡萄酒色澤不符，略失光澤，果香不足，回味較短，酒體寡淡，酒體欠平衡、粗糙；商業(yè)釀酒酵母中XR經(jīng)品評人員評價后平均得分最高為89分，色澤呈現(xiàn)紫紅色，有光澤，有明顯的果香和花香，香氣醇香濃郁，突出純正，結構感強，優(yōu)雅，余味持續(xù)時間長，典型性突出；CEC01發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒品評人員平均得分86分，色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤相符，沒有懸浮物，透明，酒體豐滿，較XR釀酒酵母相比，香氣略微遜色，酸澀味適中，苦味微淡，典型性明顯；商業(yè)釀酒酵母CECA發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒平均分為73分，葡萄酒顏色較淺，渾濁，略失光，香氣寡淡，回味較短，酒體不協(xié)調。

表5 本土與商用釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒感官評價 單位：分Table 5 Sensory evaluation of local and commercial Saccharomyces cerevisiae fermentation

結合感官評價結果，梅鹿輒葡萄酒的色澤、香氣、口感和典型性都受到不同釀酒酵母的影響，本土釀酒酵母WJ1和Q12與對照菌株XR、CEC01、CECA發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒比較發(fā)現(xiàn)，本土釀酒酵母WJ1發(fā)酵液具典型果香、酒香但略微不足，酸澀味略重，不柔和，酒體結構一般，但澄清度、色澤、香氣優(yōu)于商業(yè)釀酒酵母CECA發(fā)酵液。本土釀酒酵母Q12發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒的澄清度、香氣、滋味和典型性都不及商業(yè)釀酒酵母，色澤受釀酒酵母甘露糖蛋白對酚類物質的影響，發(fā)酵香是酵母菌代謝的副產(chǎn)物，這與釀酒酵母的發(fā)酵能力具有重要的關系，口感是香氣、酸、澀、苦等滋味的綜合評價結果。綜上所述，本土釀酒酵母WJ1可作為商業(yè)酵母用于發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒，而Q12有待進一步馴化。

3 結論

通過對全國多個釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)酵母篩選得到的4株優(yōu)良耐受性釀酒酵母均能完成果酒發(fā)酵，經(jīng)過釀造學特性研究顯示酵母菌S12嗜殺性達到了商業(yè)釀酒酵母菌的嗜殺性要求，且顯著高于商業(yè)酵母菌DS，低產(chǎn)泡性，高絮凝性(Flo 26.75%)，模擬發(fā)酵殘?zhí)?、酒精度、總酸、pH值均達到國標要求，但具有高產(chǎn)硫化氫特性，不能滿足優(yōu)良酵母菌釀造學特性；酵母菌S21嗜殺性達到了商業(yè)釀酒酵母菌的嗜殺性要求，顯著高于商業(yè)酵母菌DS，且具有中產(chǎn)泡性，中絮凝性，中產(chǎn)硫化氫特性，模擬發(fā)酵殘?zhí)恰⒕凭?、總酸、pH值均達到國標要求，但其發(fā)酵時間過長，不能滿足優(yōu)良酵母菌釀造學特性；酵母菌WJ1嗜殺性達到了商業(yè)釀酒酵母菌的嗜殺性要求，且顯著高于商業(yè)酵母菌DS、XR、CEC01，且具有低產(chǎn)泡性，高絮凝性，中產(chǎn)硫化氫特性，模擬發(fā)酵殘?zhí)?、酒精度、總酸、pH值均達到國標要求，能夠滿足優(yōu)良酵母菌釀造學特性；酵母菌Q12具有明顯嗜殺性，低產(chǎn)泡性，高絮凝性，中產(chǎn)硫化氫特性，模擬發(fā)酵殘?zhí)?、酒精度、總酸、pH值均達到國標要求，能夠滿足優(yōu)良酵母菌釀造學特性。經(jīng)過與商業(yè)菌株的對比研究得到2株本土酵母Q12、WJ1，經(jīng)過后期馴化有望為我國葡萄酒釀造提供新的本土菌種，同時為本土釀酒酵母多樣性研究提供理論依據(jù)。