易鑫，周琦，歐陽祝，談安群，范佳瑩，李則靈，朱霞建，黃林華，李貴杰，王華

(西南大學 柑桔研究所，中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，重慶，400712)

硒是維持人體健康生長的必須微量元素，是合成谷胱甘肽酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,GSH-Px2)等多種酶活性中心組成部分[1]。硒在增強免疫能力、促進生殖能力、抗氧化抗癌等方面也具有突出效果[2-3]。人體主要通過攝入谷物、水果、蔬菜、肉類等來吸收硒，但在這些食物中硒含量不足以滿足55 μg/d的推薦攝入量[4-5]。因此，可通過補硒的形式來調節(jié)硒的攝入量。補硒的來源主要有無機硒和有機硒，無機硒不易被機體吸收且存在潛在毒性；有機硒安全性高，易吸收，環(huán)境污染小，受到更廣泛的關注[6-7]。然而，自然界中有機硒含量少，合成成本高昂。因此，如何通過廉價且高效的方式來得到有機硒成為當今的研究熱點。

因此，本文以5種常用于發(fā)酵食品的乳酸菌為實驗菌，分析它們對無機硒的耐受性。在此基礎上篩選出1株富硒優(yōu)勢乳酸菌，通過單因素實驗及響應面優(yōu)化得到最佳的富硒培養(yǎng)條件，并探究富硒后乳酸菌在模擬胃腸道消化中的活性情況，以獲得富硒乳酸菌的相關數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究富硒乳酸菌發(fā)酵食品提供實驗數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

植物乳桿菌(LactobacillusplantarumCICC 20265)、鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusCICC 20257)、嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusCICC 20709)、嗜熱鏈球菌(StreptococcusthermophilusCICC 6220)；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii.subspbulgaricusCICC 20249)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸二鈉鹽(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)，大連美侖生物技術有限公司；亞硒酸鈉(分析純),美國sigma公司；3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3′3-diaminbenzidine,DAB)、叔丁醇，上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶、豬膽鹽，上海源葉生物科技有限公司；胰酶，合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州市培英實驗設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機，長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SU3500掃描電子顯微鏡、MC1000磁控濺射器，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化和生長曲線的測定

將各菌種挑取單菌落接種到液體MRS培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24～48 h，活化3代備用。將活化好的菌種以1%的接種量接入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取出1支試管放置于4 ℃保存，24 h后全部取出采用光電比濁法測定菌液的OD600nm值，并繪制生長曲線。

1.3.2 耐硒菌株的篩選

菌株復壯純化后，挑取單菌落轉接入MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)中后期。以1%的接種量分別接入含亞硒酸鈉質量濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的MRS培養(yǎng)液中進行篩選，37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察菌體情況，結合菌落數(shù)變化，挑選出生長旺盛且耐硒菌株。

1.3.3 硒含量的測定

1.3.3.1 標準曲線的繪制

硒含量測定參考楊靖鵬等[13]的方法稍作修改。準確吸取10 μg/mL 的亞硒酸鈉標準溶液0、1、2、3、4、 5 mL 分別加到50 mL燒杯中，加水至35 mL，再加入1 mL 5% EDTA-2Na溶液，搖勻，并用體積比1∶1的鹽酸調節(jié)pH值至2.5左右，各加0.5% DAB溶液4 mL，搖勻，置于暗處反應30 min，再用5% NaOH調節(jié)pH值至中性，加入分液漏斗中，并加入10 mL二甲苯振蕩2 min，靜置分層，去水層，收集有機層于比色皿中，于420 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。

1.3.3.2 殘留無機硒含量的測定

將發(fā)酵液8 000 r/min 離心15 min，取2 mL上清液于50 mL燒杯中，加水至35 mL，以下步驟同標準曲線繪制，同時以未富硒組做空白對照。用空白對照調零，測定樣品吸光值，所得數(shù)據(jù)在標準曲線上查出相應的硒含量，此為殘留的無機硒含量。根據(jù)公式(1)計算富硒率：

(1)

1.3.4 植物乳桿菌富硒培養(yǎng)單因素及響應面實驗

1.3.4.1 鹽濃度對植物乳桿菌富硒的影響

配置含亞硒酸鈉質量濃度為15 μg/mL的MRS 培養(yǎng)基，接種3%的菌液，在鹽質量濃度為0、1、2、3、4 g/100mL下37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，測定富硒率和生物量，以確定最佳鹽濃度。

1.3.4.2 亞硒酸鈉濃度對植物乳桿菌富硒的影響

配置含NaCl質量濃度2 g/100mL，亞硒酸鈉濃度分別為5、10、15、20、25 μg/mL的MRS培養(yǎng)基，接種3%的菌液，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，測定富硒率和生物量，以確定最適亞硒酸鈉濃度。

1.3.4.3 接種量對植物乳桿菌富硒的影響

分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種于NaCl質量濃度為2g/100mL和亞硒酸鈉濃度為15 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中進行富硒培養(yǎng)，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，測定富硒率和生物量，以確定最佳接種量。

1.3.4.4 響應面法優(yōu)化富硒培養(yǎng)條件

基于單因素實驗的結果，以鹽濃度、亞硒酸鈉濃度、接種量3個因素為自變量，采用Box-Behnken設計3因素3水平響應面優(yōu)化試驗。

1.3.5 掃描電鏡分析富硒乳酸菌表觀結構

將獲得的富硒植物乳桿菌6 000 r/min 離心20 min去上清，加入2.5%(體積分數(shù))戊二醛4 ℃固定，離心去上清。用pH 7.2的PBS緩沖液清洗，乙醇梯度洗脫，離心去上清再用叔丁醇置換乙醇，隨后冷凍干燥。最后，樣品噴金后進行掃描電鏡分析。

1.3.6 富硒乳酸菌模擬胃腸道耐受能力的測定方法

1.3.6.1 人工胃腸液的制備

模擬人工胃腸液參考GUO等[14]和MARTNEZ[15]的方法，稍作修改。

人工胃液，在pH值為2.0、3.0、4.0的無菌PBS緩沖液中，分別加入10%(體積分數(shù))胃蛋白酶，充分溶解后，用無菌的0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

人工腸液：在pH為8.0的無菌PBS緩沖液中，加入10%(體積分數(shù))胰蛋白酶和0.15%(體積分數(shù))膽汁鹽，充分溶解后，用無菌的0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后4 ℃過夜備用。

1.3.6.2 富硒乳酸菌模擬胃腸液消化耐受力測定

將植物乳桿菌和富硒植物乳桿菌培養(yǎng)24 h后，離心去上清液后再加生理鹽水重懸，以10%體積分數(shù)接種到上述不同pH的人工胃液中，于37 ℃、100 r/min恒溫搖床中消化4 h，每隔1 h取樣，采用平板菌落計數(shù)法測定活菌數(shù)，每個處理重復3次。然后，從上述已消化2 h、pH 3.0的人工含菌胃液中取1 mL，加入到9 mL人工腸液中，在37 ℃、100 r/min恒溫搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。在0、1、2、3、4、6、8 h取樣，用平板菌落計數(shù)法測定活菌數(shù)，每個處理重復3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復3次，試驗數(shù)據(jù)以“Mean±SD”表示，用Design-Expert 8.0.6進行響應面設計和結果分析，用 Origin 2017 軟件進行作圖，通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌生長曲線及加硒時間的確定

5種乳酸菌生長曲線如圖1所示，植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌在3 h后進入對數(shù)期，持續(xù)到12 h；鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌在3 h后進入對數(shù)期，持續(xù)到8 h。嗜熱鏈球菌在4 h后進入對數(shù)期持續(xù)至10 h。有研究證明，乳酸菌富硒轉化率與加硒時間有關，乳酸菌處于對數(shù)期時其生長代謝旺盛，富硒能力強，有機硒轉化率相比于其他時期更高[13, 16]。而加硒時間越早，對菌體的生長代謝抑制作用越強，不利于有機硒和單質硒的轉化[17]。因此選擇菌株對數(shù)期富硒，根據(jù)本研究確定植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌在6 h添加亞硒酸鈉，嗜熱鏈球菌在7 h添加亞硒酸鈉。

圖1 五種乳酸菌生長曲線Fig.1 Growth curves of 5 strains of lactic acid bacteria

2.2 耐硒菌的篩選

將5種乳酸菌分別培養(yǎng)至對數(shù)期，在含亞硒酸鈉質量濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌體顏色變化如圖2所示。通過觀察發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鈉的濃度升高，部分菌體逐漸變紅。這種現(xiàn)象是乳酸菌內(nèi)部的一種解毒過程，即將無機硒轉化為有機硒，而過量的無機硒則被轉化為紅色的單質硒[5]。有研究證明紅色單質硒對人體有諸多益處，但紅色單質硒有強烈的金屬味，會嚴重影響發(fā)酵食品的風味[9, 18]。因此本實驗選擇菌泥為微紅色適宜。由圖2可知隨著亞硒酸鈉濃度的升高，5種乳酸菌的菌落數(shù)均出現(xiàn)減小，這是因亞硒酸鈉濃度過高對菌株產(chǎn)生了抑制作用[18]。但植物乳桿菌的菌落數(shù)在不同亞硒酸鈉濃度下都高于其余4種乳酸菌。綜上，結合圖2和表1數(shù)據(jù)，篩選出富硒優(yōu)勢菌為植物乳桿菌。

a-植物乳桿菌；b-鼠李糖乳桿菌; c-嗜熱鏈球菌;d-保加利亞乳桿菌; e-嗜酸乳桿菌圖2 五種乳酸菌在不同亞硒酸鈉濃度下培養(yǎng)24 h后菌體顏色變化Fig.2 Color change of 5 lactic acid bacteria were cultured at different concentrations of sodium selenite for 24 h

表1 不同濃度下亞硒酸鈉對乳酸菌生長情況的影響Table 1 Effect of different concentration sodium selenite on LAB growth

注：小寫字母表示同一行顯著性差異(P<0.05),大寫字母表示同一列顯著性差異(P<0.05)

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 鹽濃度對植物乳桿菌富硒效果的影響

由圖3可以得到，隨著NaCl濃度的增加，植物乳桿菌生物量不斷升高，富硒率在鹽質量濃度為2 g/100mL時達到最大，為83.23%。與徐穎等[19]的研究相似，發(fā)現(xiàn)在一定鹽濃度脅迫下，能增加鼠李糖乳桿菌的富硒量。這可能是由于乳酸菌在鹽脅迫下，外界滲透壓增大，自身通過誘導相關酶表達，從而增加谷氨酸、脯氨酸、甜菜堿和甘氨酸等可溶性溶質的生成來緩解外界的高滲透壓，以保持細胞內(nèi)外平衡。而這些可混溶性溶質合成的關鍵酶如甘氨酸還原酶、脯氨酸還原酶、甜菜堿還原酶都是硒蛋白酶[20]。因此鹽脅迫促進了乳酸菌對硒的轉化作用。

圖3 鹽濃度對富硒效果的影響Fig.3 Effect of salt concentration on selenium enrichment

2.3.2 亞硒酸鈉濃度對植物乳桿菌富硒效果的影響

由圖4可知，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，植物乳桿菌的生物量從2.626 g/L 降低到2.062 g/L，說明亞硒酸鈉對乳酸菌有一定的抑制作用。但隨著亞硒酸鈉質量濃度增加富硒率出現(xiàn)升高后降低再升高的趨勢，結合乳酸菌的生物量變化，這可能是由于亞硒酸鈉質量濃度逐漸增加，導致乳酸菌出現(xiàn)病理性富硒，即菌體自身代謝遭到破壞[21]。綜合考慮選擇亞硒酸鈉質量濃度15 μg/mL。

圖4 亞硒酸鈉濃度對富硒效果的影響Fig.4 Effect of sodium selenite on selenium enrichment

2.3.3 接種量對植物乳桿菌富硒效果的影響

如圖5所示，隨著接種量的增加，植物乳酸菌的生物量也隨之增加，富硒率在接種量為3%時，達到最大值82.63%，隨后富硒率下降，這是因為隨著接種量增加培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分也被大量消耗，在培養(yǎng)后期菌體之間相互競爭，富硒含量反而下降[22]。因此選擇3%的接種量。

圖5 接種量對富硒效果的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on selenium enrichment

2.4 響應面結果分析

2.4.1 響應面設計方案與實驗結果

以單因素試驗結果為依據(jù)，采用響應面法對鹽質量濃度、亞硒酸鈉質量濃度、接種量3個因素進行3因素3水平的響應面設計與分析，各因素水平如表2所示，試驗設計及結果如表3所示。

表2 響應面試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface in fermentation process

2.4.2 模型的建立及顯著性分析

表3 響應面設計方案及結果Table 3 Response surface design scheme and results

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

注： *，P< 0.05，差異顯著；**，P< 0.01，差異極顯著

2.4.3 響應面分析

根據(jù)回歸方程，得到各因素交互作用對植物乳酸菌富硒率的響應面圖和等高線圖。通過等高線的線密度以及形狀可以反映交互作用的強弱，即等高線越密集且趨近橢圓形表明兩因素交互作用顯著，反之則不顯著[23]。由圖6-a可知，通過等高線可以得到因素A和因素B交互作用對植物乳酸桿菌富硒率影響較顯著(P<0.05)；由6-b可知，當接種量不變時，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，富硒率先升高后降低，隨著鹽質量濃度增加，富硒率上升后緩慢下降，亞硒酸鈉質量濃度的曲面要陡一些，因此亞硒酸鈉對富硒率的影響比鹽質量濃度要更顯著一些。由圖6-c可知，等高線可得到因素B和因素C交互作用對富硒率有極顯著影響(P<0.01)。由圖6-d可知，在鹽質量濃度一定的情況下，隨著亞硒酸鈉質量濃度和接種量的增加，富硒率先升高后降低，在接種量2.5%～3.5%出現(xiàn)峰值，在亞硒酸鈉質量濃度16～20 μg/mL之前出現(xiàn)峰值，即為富硒率最高的接種量、亞硒酸鈉質量濃度條件。

a-因素A和因素B交互作用等高線圖；b-因素A因素B交互作用響應面圖；c-因素B和因素C交互作用等高線圖；d-因素B因素C交互作用響應面圖圖6 各因素交互作用對植物乳桿菌富硒率影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Response surface and contour polts showing the effect of various factors on rate of Lactobacillus plantarum Se-enriched

2.4.4 驗證試驗

通過響應面進行分析，得到最佳富硒率條件為：鹽質量濃度2.33 g/100mL，亞硒酸鈉質量濃度16.56 μg/mL，接種量2.91%，此條件下計算最佳富硒率為84.66%。綜合實際操作，將條件修正為鹽質量濃度2 g/100mL，亞硒酸鈉質量濃度16 μg/mL，接種量3%。最終得到富硒率為84.26%，與理論值接近，證明該模型可靠。

2.5 富硒植物乳桿菌菌體掃描電鏡分析

SU3500型掃描電子顯微鏡對富硒后的植物乳桿菌進行表面結構觀察，結果如圖7所示。在未富硒條件(圖7-a)，植物乳桿菌表面光滑，呈現(xiàn)短桿狀。富硒植物乳桿菌(圖7-b)表面有單質硒析出，此外與未富硒組無顯著變化。MARTNEZ等[15]在研究中也發(fā)現(xiàn)富硒短乳桿菌周圍出現(xiàn)納米硒微球，這是由于乳酸菌能夠將無機態(tài)的硒還原成單質硒。同時與楊靖鵬等[13]在富硒乳酸菌掃描電鏡相比，植物乳桿菌在富硒后未出現(xiàn)變形、表面粗糙等現(xiàn)象。說明在該條件下植物乳桿菌富硒效果很好，較高的保持原有的形狀且有少量單質硒析出。

a-未富硒植物乳桿菌菌體細胞;b-富硒植物乳桿菌菌體細胞圖7 植物乳桿菌富硒前后掃描電鏡圖Fig.7 Microphotographs of before and after selenium enriched of Lactobacillus plantarum注：圖7-b中紅圈為單質硒

2.6 富硒植物乳酸菌在模擬胃腸道耐受能力的測定

2.6.1 富硒植物乳桿菌人工胃液消化過程

正常人體胃液pH值在1.5～4波動，胃排空一般在3～5 h[14]。本實驗將富硒植物乳桿菌和植物乳桿菌分別在pH 2、 3、 4下消化4 h觀察其菌落數(shù)及存活率的變化。如圖8-a所示，在pH值為2時，富硒組和未富硒組菌落數(shù)均急劇下降，4 h后富硒組菌落數(shù)由8.58 lgCFU/mL降至7.98 lgCFU/mL，未富硒組菌落數(shù)由8.8 lgCFU/mL降至8.13 lgCFU/mL，富硒組存活率為25.55%，顯著大于未富硒組存活率20.70%(P<0.05)。圖8-b所示，在pH值為3時，在4 h內(nèi)富硒組和未富硒組活菌數(shù)和存活率較pH 2明顯上升，富硒組存活率達到44.03%，未富硒組達40.04 %(P<0.05)。如圖8-c所示，pH值為4時，富硒組活菌數(shù)由8.51 lgCFU/mL降至8.19 lgCFU/mL，空白組活菌數(shù)由8.8 lgCFU/mL降至8.43 lgCFU/mL，存活率富硒組為46.16 % 顯著大于未富硒組43.66 %(P<0.05)。

2.6.2 富硒植物乳桿菌人工腸液消化過程

人體腸液含有大量的水分和各種酶、膽汁鹽等物質，pH值在7.5左右，對腸道菌群有一定的阻力[25]。固體或液體食物在小腸一般6～8 h消化完畢[24]，本實驗將消化2 h的pH 3含菌人工胃液繼續(xù)加入到人工腸液中繼續(xù)消化，消化8 h觀察其存活情況，結果如圖8-d所示。隨著時間的推移，富硒組和未富硒組在胰酶消化和膽鹽抑制下菌落數(shù)不斷降低，富硒組由8.29 lgCFU/mL降至7.34 lgCFU/mL；空白組由8.45 lgCFU/mL降至7.46 lgCFU/mL。存活率富硒組8 h后降至12.32%，空白組存活率為10.23%。

富硒植物乳桿菌在不同pH胃液和腸液都表現(xiàn)出比未富硒有更強的存活率，且消化后活菌數(shù)達到6 lgCFU/mL以上，達到了益生菌食品要求的活菌數(shù)量值[26]。這一結論與MARTNEZ等[15]研究相似，對比富硒和未富硒的短乳桿菌CRL 2051發(fā)酵果蔬汁后，在模擬胃腸液消化下，富硒短乳桿菌表現(xiàn)更高的存活率。ALZATE等[9]在研究富硒乳酸菌發(fā)酵乳中也發(fā)現(xiàn)富硒后的保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌在發(fā)酵4周后比未富硒組具有更高的存活率。結合圖7掃描電鏡圖分析，推測富硒乳酸菌表現(xiàn)出較強存活率可能與菌體富硒后析出的單質硒有關，單質硒依附在菌體周圍使其具有較強的耐受能力。

a-人工胃液pH 2；b-人工胃液pH 3；c-人工胃液pH 4；d-人工腸液圖8 富硒植物乳桿菌在不同pH人工胃液和腸液中消化過程的活菌數(shù)Fig.8 The viable counts of Se-enriched Lactobacillus plantarum during digestion in artificial gastric and intestinal juices at different pH levels注： *， P < 0.05，差異顯著；**， P < 0.01，差異極顯著

3 結論

本實驗測定了5種常用于發(fā)酵食品的乳酸菌生長曲線，確定適宜的加硒時間，通過觀察乳酸菌菌體情況，結合菌落數(shù)變化，篩選出植物乳桿菌為耐硒菌。進一步優(yōu)化富硒條件，確定植物乳桿菌最佳富硒條件為NaCl質量濃度2 g/100mL，亞硒酸鈉質量濃度16 μg/mL，接種量為3%。最終富硒率為84.26%，與理論值84.66%接近。從掃描電鏡結果分析，該條件下富硒植物乳桿菌與未富硒植物乳酸菌表面無明顯差異，經(jīng)富硒后表面有少量單質硒析出。且在模擬胃腸液消化后，發(fā)現(xiàn)富硒植物乳桿菌存活率顯著高于未富硒組(P<0.05)，具有更強的耐受性。綜上所述，在該優(yōu)化條件下植物乳桿菌富硒效果好，且能保持較高的活性，為后續(xù)研究富硒乳酸菌發(fā)酵食品提供了實驗數(shù)據(jù)支撐。