秦晉穎，謝曉林，趙 元，張新鳳，吳 倩，王昌勝，劉志剛?

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005；2.貴州黃果樹立爽藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550004）

艾納香油為菊科植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.葉中分離而得的油，是我國(guó)西南少數(shù)民族習(xí)用藥物［1］。L-龍腦為艾納香油中主要活性成分，此外還含有β-石竹烯、樟腦、β-蒎烯和芳樟醇等成分［2-3］，具有鎮(zhèn)痛、抗菌和消炎的藥理活性，是多種貴州民族藥成方制劑的組方藥物［4-10］。艾納香藥材來(lái)源較復(fù)雜，偽品較多，目前艾納香油的壓榨工藝并不統(tǒng)一，現(xiàn)有地方標(biāo)準(zhǔn)采用恒溫GC外標(biāo)法對(duì)龍腦含有量進(jìn)行定量測(cè)定，色譜分離效果差，且樟腦和β-蒎烯等有效成分的含有量沒有得到控制，單一成分含有量測(cè)定已難以全面反映艾納香油的質(zhì)量，多指標(biāo)定量測(cè)定已成為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)［11］。傳統(tǒng)的多指標(biāo)定量測(cè)定存在著對(duì)照品消耗量大、操作復(fù)雜和容易導(dǎo)致誤差等缺陷，一測(cè)多評(píng)法已被用于中藥化學(xué)成分的含有量測(cè)定［12-18］，2015 年版《中國(guó)藥典》 一部收載黃連藥材中巴馬汀、小檗堿、表小檗堿和黃連堿4 種主要成分的含有量采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定。本研究建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定艾納香油中的5 種成分含有量，并與傳統(tǒng)內(nèi)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較，以期為全面提升艾納香油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，并為相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

島津GC-2014 型氣相色譜儀（配Aoc-20i+s 自動(dòng)進(jìn)樣器）、LAB Solution 色譜工作站（日本島津公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；FA124 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

β-蒎烯（批號(hào)111827-201508）、樟腦（批號(hào)110747-201609）、龍腦（批號(hào)110881-201311）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98.0%；β-石竹烯（批號(hào)181020）和α-石竹烯（批號(hào)180926）對(duì)照品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，純度均大于96.0%。高純氮?dú)?、氫氣和干燥空氣體積分?jǐn)?shù)均為99.999%（貴州特建氣體有限公司）；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用8 批艾納香藥材于2017 年10 月采自貴州省羅甸縣，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院周漢華教授鑒定為菊科植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的葉，其粗升華物經(jīng)過(guò)壓榨分離而得到艾納香油樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)法建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱采用PEG-20 M 交聯(lián)毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；載氣采用氮?dú)?；分流進(jìn)樣模式；分流比10∶1；程序升溫（起始溫度70 ℃，維持2 min，以5 ℃/min 速率升溫至150 ℃，維持2 min）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；采用FID 檢測(cè)器，溫度240 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對(duì)照品貯備液制備 分別取β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦對(duì)照品適量，精密稱定，用乙酸乙酯溶解，制成每1 mL 分別含上述5種成分0.372、0.556、1.62、0.912、4.10 mg 對(duì)照品貯備液。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備 取適量水楊酸甲酯，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.4 混合對(duì)照品溶液制備 精密量取β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦對(duì)照品貯備液各2.0 mL 至10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度分別為β-蒎 烯0.074 4 mg/mL、β-石竹烯0.111 mg/mL、樟腦 0.324 mg/mL、α-石竹烯0.182 mg/mL 和龍腦0.820 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.5 供試品溶液制備 取艾納香油樣品約0.2 g，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，精密加入前述內(nèi)標(biāo)液1.0 mL，加乙酸乙酯定容至刻線，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、1.0、2.0、5.0、8.0 mL 分別置于10 mL 量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，組成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取各混合對(duì)照品溶液1.0 μL，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，表明β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.7 相對(duì)校正因子測(cè)定 精密吸取上述不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液1.0 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄不同質(zhì)量濃度對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積，以龍腦為內(nèi)參物，計(jì)算β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯的相對(duì)較正因子，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯的相對(duì)較正因子分別為0.513、0.592、0.401、0.639，RSD 分別為1.1%、1.5%、0.9%、1.6%。

2.1.8 精密度試驗(yàn) 取“2.1.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD 值，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦峰面積比值的RSD 分別為0.8%、0.9%、0.2%、0.7%、0.2%，表明該方法精密度良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批艾納香油樣品6 份（1 號(hào)樣品），精密稱定，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦的含有量分別為13.1、16.6、71.5、26.9、232 mg/g，RSD 分別為1.3%、1.6%、0.9%、1.7%和1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 號(hào)艾納香油樣品，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于室溫放置的0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積作比較，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦峰面積比值的RSD 分別為1.4%、1.1%、0.7%，1.3%、0.8%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含有量已知的艾納香油樣品6 份（1 號(hào)樣品），每份樣品分別精密加入4.0 mL 混合對(duì)照品溶液（β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦質(zhì)量濃度分別為0.344、0.429、1.83、0.695、5.27 mg/mL），按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.2 一測(cè)多評(píng)法的耐用性

2.2.1 重復(fù)性考察 精密吸取上述5 種成分混合對(duì)照品系列對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄各對(duì)照品與內(nèi)參物峰面積，計(jì)算各成分的相對(duì)較正因子，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯 的相對(duì)較正因子分別為0.519、0.586、0.409、0.627，RSD 分別為2.6%、3.1%、2.9%、4.1%，表明相對(duì)校正因子的重復(fù)性良好。

2.2.2 不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響 采用PEG-20M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）石英毛細(xì)管柱，分別考察了島津GC-2014C 氣相色譜議和Agilent 6890 N 氣相色譜系統(tǒng)對(duì)艾納香油中幾種成分相對(duì)校正因子的影響。測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯相對(duì)較正因子RSD 分別為3.3%、3.8%、4.7%、3.8%，表明不同氣相色譜系統(tǒng)對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.3 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 采用島津GC-2014C 氣相色譜系統(tǒng)，分別考察了KBWax氣相色譜毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）、中科院蘭州物化所PEG-20 M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）、大連中匯達(dá)PEG-20M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）3 種不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯相對(duì)較正因子的RSD 分別為3.1%、2.6%、3.3%、2.9%，表明色譜柱對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。

2.2.4 色譜峰定位 為了能夠確認(rèn)β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯色譜峰的位置，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算含有量，從而達(dá)到一測(cè)多評(píng)的目的。本實(shí)驗(yàn)分別考察了采用不同儀器和色譜柱時(shí)，4 種成分相對(duì)于內(nèi)參物龍腦色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各成分相對(duì)保留時(shí)間在不同儀器和色譜柱條件下變化較小，結(jié)果見表3。

2.3 一測(cè)多評(píng)法與內(nèi)標(biāo)法結(jié)果比較 采用一測(cè)多評(píng)法對(duì)6 批艾納香油中β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯4 種成分進(jìn)行含有量測(cè)定，結(jié)果見表4，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)內(nèi)標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的2 組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，結(jié)果2 種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，表明一測(cè)多評(píng)法可用于艾納香油中5 種成分的含有量測(cè)定。

3 討論

一測(cè)多評(píng)法是在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，選擇藥材中某一廉價(jià)、易得和有效組分為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子，以計(jì)算其他組分含有量。艾納香油中龍腦含有量最高，可獲得性較好，價(jià)格適中，且穩(wěn)定性較好，故選擇龍腦作為內(nèi)參照物，建立其與β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯的相對(duì)校正因子，采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)檢測(cè)艾納香油中5 種活性成分含有量，實(shí)現(xiàn)了低成本對(duì)多種成分的同步測(cè)定。方法學(xué)考察結(jié)果表明，方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好，在對(duì)照品缺乏的前提下，一測(cè)多評(píng)法可以作為一種快捷、準(zhǔn)確的方法應(yīng)用于艾納香油的質(zhì)量控制。

表3 不同儀器和色譜柱上保留時(shí)間Tab.3 Retention time on different instruments and columns

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

在一測(cè)多評(píng)法建立的過(guò)程中，有多種因素會(huì)影響相對(duì)校正因子，本研究中考察了不同型號(hào)氣相色譜儀及不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，測(cè)得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯在各色譜條件下相對(duì)校正因子的RSD 均小于5%，并且5 種成分出峰順序均不受色譜系統(tǒng)的影響，符合一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南中的要求［10］，不同色譜儀及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。在色譜峰定位時(shí)，采用相對(duì)保留時(shí)間作為色譜峰定位參數(shù)。在不同色譜條件下，相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性良好，其RSD 均小于5%，從而驗(yàn)證了一測(cè)多評(píng)法在艾納香油質(zhì)量控制中的可行性與技術(shù)適應(yīng)性。