高 揚(yáng)，李慧靜，陸永躍，程代鳳*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642)

桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis是一種可對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害的害蟲，其經(jīng)濟(jì)寄主超過 150多種水果和蔬菜(Chenetal., 2008; Schutzeetal., 2017)。目前，桔小實(shí)蠅已在熱帶和亞熱帶的大部分地區(qū)廣泛分布，并且被許多國(guó)家和地區(qū)列為檢疫性有害生物。已有研究表明，植物源揮發(fā)物可有效引誘或驅(qū)避桔小實(shí)蠅，某些揮發(fā)物已被用于桔小實(shí)蠅監(jiān)測(cè)。例如，植物源的甲基丁香酚可強(qiáng)烈地引誘桔小實(shí)蠅的雄蟲(Tanetal., 2014)，接觸過甲基丁香酚的雄蟲會(huì)獲得交配競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)(Shelly 2000; Vargasetal., 2010; Tan and Nishida 2012; Tanetal., 2014)。另外，甲基丁香酚還可以驅(qū)避桔小實(shí)蠅的寄生蜂(Guetal., 2018)。香茅草中的香茅醛可顯著驅(qū)避桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵(Yietal., 2014)，芒果中的γ-辛內(nèi)酯、惕各酸乙酯、苯并噻唑和蘑菇醇則可影響桔小實(shí)蠅對(duì)產(chǎn)卵場(chǎng)所的選擇(Kamala Jayanthietal., 2014; Pagadala Damodarametal., 2014; Pagadala Damodarametal., 2015)。

β-石竹烯(beta-caryophyllene)是一種許多植物都能合成的揮發(fā)物，研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對(duì)昆蟲具有雙重效果。例如β-石竹烯對(duì)赤擬谷盜Triboliumcastaneum和嗜卷書虱Liposcelisbostrychophila(Wangetal., 2019)具有非常顯著的驅(qū)避作用，對(duì)中華蜜蜂Apiscerana(Annammaetal., 2018)、煙青蟲Helicoverpaassulta(Sunetal., 2012)和斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fangetal., 2018)則有顯著的引誘作用。中華蜜蜂在覓食過程中會(huì)顯著偏好于可產(chǎn)生β-石竹烯的Jacquemontiapentanthos(Annammaetal., 2018)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)β-石竹烯對(duì)庫(kù)蚊Culextritaeniorhynchus、按蚊Anophelessubpictus和伊蚊Aedesalbopictus有非常高的毒性(Govindarajanetal., 2016)。植物中β-石竹烯還可被植食性昆蟲取食誘導(dǎo)并選擇性地引誘植食性昆蟲的寄生天敵(Kollneretal., 2008)。

已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道β-石竹烯對(duì)實(shí)蠅類昆蟲行為的影響。例如，在缺少β-石竹烯的情況下白漿果對(duì)繞實(shí)蠅Rhagoletiszephyria的吸引力會(huì)顯著下降(Chaetal., 2017)。β-石竹烯和α-蛇麻烯的混合物會(huì)強(qiáng)烈的引誘番石榴實(shí)蠅(Jaleeletal., 2019)。芒果中的β-石竹烯則可以引起地中海實(shí)蠅顯著的觸角電位反應(yīng)，而且對(duì)雌蟲的反應(yīng)要顯著強(qiáng)于雄蟲(Cosséetal., 1995)。然而，關(guān)于β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵行為的影響尚未見報(bào)道。本文對(duì)桔小實(shí)蠅3種寄主水果揮發(fā)物進(jìn)行了鑒定，測(cè)試了共有物質(zhì)β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅的引誘作用，為開發(fā)該蟲植物源誘集提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試?yán)ハx

桔小實(shí)蠅于2016年5-6月采集于廣東省廣州市楊桃公園，在室內(nèi)溫度25±1℃、相對(duì)濕度70%～80%、光周期16 L ∶8 D的養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室桔小實(shí)蠅使用人工飼料飼養(yǎng)(Chengetal., 2017)。

1.1.2供試材料及藥品配制

β-石竹烯精油(95%，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，CAS:87-44-5)500 mL密度0.9 g/cm3。分別用無水乙醇稀釋至0.9、9、90和900 μg/mL的溶液，冰箱低溫(-18℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1產(chǎn)卵選擇實(shí)驗(yàn)

取30頭處于產(chǎn)卵期的桔小實(shí)蠅雌蟲置于一個(gè)長(zhǎng)寬高均為40 cm的籠子中，在籠子中放置特制的產(chǎn)卵誘集盒(一個(gè)高和直徑均為3 cm的圓柱形食料盒，盒蓋上鉆有3排12個(gè)小孔供實(shí)蠅產(chǎn)卵)對(duì)實(shí)蠅卵進(jìn)行收集。分別在市場(chǎng)購(gòu)買番石榴、橙子和芒果，將3種水果分別用榨汁機(jī)勻漿成果泥。分別在產(chǎn)卵誘集盒中加入2 g果泥放入實(shí)蠅籠子中進(jìn)行產(chǎn)卵誘集，3 h后取出誘集盒并計(jì)算誘集盒中實(shí)蠅卵的數(shù)量。

在測(cè)試β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵的影響時(shí)，取 4個(gè)產(chǎn)卵誘集盒放置于籠子中，在誘集盒中分別加入2 g番石榴果泥，其中3個(gè)誘集盒中的果泥分別混入9、90和900 μg β-石竹烯(體積為1 mL)，另一個(gè)加入同樣體積的無水乙醇作為空白對(duì)照。對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵誘集3 h后取出誘集盒并計(jì)算每個(gè)誘集盒中實(shí)蠅卵的數(shù)量。

1.2.2果實(shí)中揮發(fā)物的鑒定

用氣相質(zhì)譜(GC-MS)(安捷倫科技有限公司，GC:7890B, MS:5977B)分析方法對(duì)番石榴、橙子和芒果中揮發(fā)物進(jìn)行鑒定。具體操作方法：將2 g果泥添加到一個(gè)20 mL的棕色瓶中，然后用100-μm聚二甲基硅氧烷固相微萃取萃取頭(PMDS)對(duì)果泥中揮發(fā)物進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為40 min，萃取溫度為水浴37℃。萃取結(jié)束后將萃取頭插入氣相質(zhì)譜儀的進(jìn)樣口，在250℃下熱解析3 min后進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析。氣相質(zhì)譜條件，柱子：HP-5 MS (30 m, 0.25 mm內(nèi)徑, 0.25 μm厚度)；載氣：110.9 kPa氦氣；柱箱溫度50℃保持2 min，以5℃/min升至140℃，其后以10℃/min升至250℃，保持10 min。β-石竹烯根據(jù)NIST普庫(kù)中的特征離子片段進(jìn)行鑒定，同時(shí)購(gòu)買β-石竹烯的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)鑒定到的β-石竹烯進(jìn)行再次確認(rèn)。為了測(cè)定果泥中β-石竹烯的絕對(duì)含量，取β-石竹烯的標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇稀釋至250，25，2.5，0.25，0.025，0.0025 μg/μL 6個(gè)濃度梯度，取2 mL不同濃度梯度的β-石竹烯用PMDS萃取頭在水浴37℃萃取40 min后在氣相質(zhì)譜儀中進(jìn)樣檢測(cè)，對(duì)β-石竹烯的峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品中β-石竹烯的峰面積可用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-石竹烯的濃度。

1.2.3桔小實(shí)蠅雌蟲觸角電位(GC-EAD)測(cè)試

用GC-EAD方法測(cè)試桔小實(shí)蠅雌蟲觸角對(duì)β-石竹烯的反應(yīng)。氣相色譜(7890B)條件，柱子：HP-5 (30 m, 0.25 mm內(nèi)徑, 0.25 μm厚度)；載氣：110.9 kPa氦氣；柱箱溫度：40℃保留2 min，10℃/min升至250℃，保留5 min。將桔小實(shí)蠅雌蟲頭部沿中間切下，將其中一個(gè)觸角末端切開，然后連接到觸角電位儀的兩個(gè)玻璃電極上，其中參考電極連接頭部，記錄電極連接觸角端部。在氣相色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)1 μL β-石竹烯 (10 μg/mL，測(cè)試桔小實(shí)蠅的觸角電位反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中測(cè)試3對(duì)以上雌蟲觸角對(duì)β-石竹烯的反應(yīng)。

1.2.4桔小實(shí)蠅對(duì)β-石竹烯的嗅覺反應(yīng)測(cè)試

應(yīng)用一個(gè)Y型嗅覺儀測(cè)試單頭桔小實(shí)蠅雌蟲對(duì)β-石竹烯的行為反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)試雌蟲對(duì)900、90、9和0.9 μg/mL β-石竹烯(溶于無水乙醇當(dāng)中)的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中，在Y型嗅覺儀的一個(gè)味源瓶中加入1 mL β-石竹烯溶液，另一個(gè)味源瓶中加入1 mL無水乙醇作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程中保持氣流流速為1.3 L/min。雌蟲放入Y型管中觀察5 min，當(dāng)雌蟲進(jìn)入Y型管一側(cè)超過3 cm且停留時(shí)間超過1 min則記為1個(gè)有效選擇。實(shí)驗(yàn)過程中只統(tǒng)計(jì)有效選擇的蟲數(shù)。在進(jìn)行10個(gè)有效重復(fù)后，將裝置拆解開用酒精進(jìn)行沖洗并烘干，然后再進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)記錄60個(gè)有效重復(fù)。

應(yīng)用一個(gè)四臂嗅覺儀(中央昆蟲活動(dòng)室：55 cm長(zhǎng)，3 cm深)測(cè)試桔小實(shí)蠅雌蟲群體對(duì)β-石竹烯的反應(yīng)。在四臂嗅覺儀四個(gè)臂的味源瓶中分別加入1 mL無水乙醇，0.9、9和90 μg/mL β-石竹烯溶液，在4個(gè)臂中持續(xù)通入1.3 L/min的氣流，各項(xiàng)條件準(zhǔn)備好后在昆蟲活動(dòng)室中放入100頭處于產(chǎn)卵期的桔小實(shí)蠅雌蟲。實(shí)驗(yàn)中將整個(gè)裝置用不透光的黑布罩住，防止光源對(duì)實(shí)蠅的選擇造成影響。實(shí)驗(yàn)4次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用卡方檢驗(yàn)(P<0.05)分析Y型嗅覺儀中處理與對(duì)照間差異，單因素方差分析比較不同果中產(chǎn)卵量及石竹烯含量的差異，Kendall非參數(shù)檢驗(yàn)比較分析四臂嗅覺儀中雌蟲對(duì)β-石竹烯各濃度的選擇及產(chǎn)卵差異，以上分析均使用SPSS 17。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試水果果泥對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵的引誘作用

3種水果的果泥均可引誘處于產(chǎn)卵期的桔小實(shí)蠅雌蟲產(chǎn)卵，3 h內(nèi)每種果泥均能誘集到超過200粒卵，且3種水果誘集到卵的數(shù)量無顯著差異(F2, 26=3.189，P=0.0577; 圖1)。這表明所選水果果泥中均可能存在引誘桔小實(shí)蠅雌蟲產(chǎn)卵的揮發(fā)物。

2.2 果泥中β-石竹烯含量及雌蟲對(duì)其觸角電位反應(yīng)

應(yīng)用GC-MS分析中發(fā)現(xiàn)，番石榴、橙子和芒果中均含有β-石竹烯(圖2)，而且3種水果中β-石竹烯的含量沒有顯著差異(F2, 15=3.049，P=0.0774; 圖3)。另外，10 μg/mL的β-石竹烯能夠引起所有測(cè)試雌蟲的觸角電位反應(yīng)(圖4)。

圖1 不同水果上桔小實(shí)蠅的產(chǎn)卵量Fig.1 Egg of the fruit fly on the different fruits注：圖中黑點(diǎn)數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，相同字母表示數(shù)據(jù)示鄧肯氏多重比較在0.05水平上差異不顯著。Note: Number of black dots means the biological replicates. Same letters indicated figure was not different by Duncan’s test at 0.05 level.

圖2 果實(shí)中β-石竹烯的GC-MS鑒定Fig.2 Identification of β-caryophyllene by GC-MS

圖3 3種水果中β-石竹烯的含量Fig.3 β-caryophyllene content in fruits注：A，β-石竹烯定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B，β-石竹烯在果實(shí)中的含量。圖中黑點(diǎn)數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，相同字母表示數(shù)據(jù)示鄧肯氏多重比較在0.05水平上差異不顯著。Note: A, Standard curve of β-caryophyllene quantification; B, Content of β-caryophyllene in different fruits. Number of black dots means the biological replicates. Same letters indicated figure was not different by Duncan’s test at 0.05 level.

圖4 桔小實(shí)蠅雌蟲對(duì)β-石竹烯的觸角電位反應(yīng)Fig.4 Electroantennogram response of β-caryophyllene to female antenae

2.3 β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅雌蟲的引誘作用

Y型嗅覺儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9 μg/mL的β-石竹烯可顯著引誘桔小實(shí)蠅，而0.9、90和900 μg/mL的β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅雌蟲均無顯著誘集作用(圖5)；四臂嗅覺儀實(shí)驗(yàn)也表明桔小實(shí)蠅雌蟲會(huì)顯著趨向于9 μg/mL的β-石竹烯，當(dāng)β-石竹烯濃度高于9 μg/mL時(shí)，β-石竹烯濃度越高對(duì)實(shí)蠅的誘集效果就越差(Kendall W=0.728, df=3,P=0.012, 圖6)。另外，產(chǎn)卵誘集實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步表明果泥中β-石竹烯含量在10.09 μg/g(自然情況下果中β-石竹烯的濃度)左右時(shí)可顯著誘集桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵，且當(dāng)果中β-石竹烯濃度高于自然情況下的濃度時(shí)，β-石竹烯濃度越高誘集實(shí)蠅產(chǎn)卵的數(shù)量就越少(Kendall W=0.396, df=3,P=0.008, 圖7)。

圖5 雌蟲在Y型嗅覺儀中對(duì)不同濃度β-石竹烯的選擇Fig.5 Selection of females to different concentration of β-caryophyllene注：NS，差異不顯著；***, P < 0.01。Note: NS, no difference；***, P < 0.01.

圖6 雌蟲在四臂嗅覺儀中對(duì)不同濃度β-石竹烯的選擇Fig.6 Selection of females to different concentration of β-caryophyllene注：圖中黑點(diǎn)數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Kendall非參數(shù)檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著。Note: Number of black dots means the biological replicates. Different letters indicated figure significantly different by Kendall nonparametric test at 0.05 level.

圖7 番石榴中不同含量β-石竹烯對(duì)產(chǎn)卵量的影響Fig.7 Effect of β-caryophyllene concentration in guava on oviposition注：圖中黑點(diǎn)數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，番石榴果β-石竹烯原始濃度為10.7 μg/g，圖中不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Kendall非參數(shù)檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著。Note: Number of black dots means the biological replicates. β-caryophyllene concentration in guava is 10.7 μg/g. Different letters indicated figure significantly different by Kendall nonparametric test at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)番石榴、橙子和芒果3種水果的果泥對(duì)桔小實(shí)蠅雌蟲產(chǎn)卵均具有較好的引誘作用，通過對(duì)3種水果果泥中的揮發(fā)物進(jìn)行鑒定和功能研究發(fā)現(xiàn)β-石竹烯是3種果泥中共有的揮發(fā)物；β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅雌蟲產(chǎn)卵具有顯著的引誘作用，但這種引誘作用取決于β-石竹烯的濃度，當(dāng)果泥中β-石竹烯濃度為9 μg/g時(shí)對(duì)雌蟲產(chǎn)卵的誘集效果最好，而當(dāng)β-石竹烯濃度高于9 μg/g時(shí)誘集效果則會(huì)下降，甚至?xí)?qū)避實(shí)蠅產(chǎn)卵。本研究首次報(bào)道了β-石竹烯濃度與桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵誘集效果之間的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)桔小實(shí)蠅雌蟲對(duì)寄主進(jìn)行產(chǎn)卵選擇的行為具有重要意義。

研究結(jié)果表明，低濃度的β-石竹烯對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵具有引誘效果，而高濃度下引誘效果會(huì)減弱甚至產(chǎn)生驅(qū)避效果。這說明桔小實(shí)蠅對(duì)β-石竹烯的嗅覺反應(yīng)受不同劑量β-石竹烯的影響。這種現(xiàn)象在其他雙翅目昆蟲中同樣存在。劉燕等(2018)發(fā)現(xiàn)β-石竹烯在低劑量下，對(duì)斑翅果蠅Drosophilasuzukii雌成蟲產(chǎn)卵行為表現(xiàn)為引誘效果，而高劑量下對(duì)其表現(xiàn)為產(chǎn)卵驅(qū)避效果，且隨劑量升高，單雌累積產(chǎn)卵量呈下降趨勢(shì)。另外，在模式生物果蠅中也存在這種現(xiàn)象。例如，低濃度的醋酸會(huì)顯著引誘果蠅，而高濃度的醋酸對(duì)果蠅的吸引作用則會(huì)顯著下降(Semmelhack & Wang, 2009)；果蠅對(duì)一些鹽的趨性也存在類似的劑量效應(yīng)，低鹽食物可顯著引誘，而高鹽食物則會(huì)驅(qū)避果蠅(Zhangetal., 2013)。通過對(duì)相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，果蠅對(duì)不同濃度的醋酸表現(xiàn)出的趨向或驅(qū)避反應(yīng)是通過激活不同的嗅神經(jīng)小球來介導(dǎo)的，低濃度的醋酸可激活DM1和VA2兩個(gè)嗅神經(jīng)小球進(jìn)而引起果蠅的趨向反應(yīng)，而高濃度的醋酸則會(huì)激活另外的嗅神經(jīng)小球從而引起驅(qū)避反應(yīng)(Semmelhack & Wang, 2009)。果蠅對(duì)不同濃度鹽分的識(shí)別是通過不同的味覺神經(jīng)元介導(dǎo)的，一種名為IR76b的促離子型谷氨酸受體是用于識(shí)別低濃度的鹽分的，而高濃度的鹽分則是通過另外的受體識(shí)別的(Zhangetal., 2013)。桔小實(shí)蠅對(duì)不同濃度的β-石竹烯表現(xiàn)出的不同反應(yīng)是否也是由類似機(jī)制介導(dǎo)則還需進(jìn)一步證實(shí)。

近些年有許多研究人員對(duì)桔小實(shí)蠅的寄主選擇行為進(jìn)行了研究。金菊等(2015)發(fā)現(xiàn)不同品種的蓮霧果實(shí)對(duì)桔小實(shí)蠅的引誘效果存在顯著差異，同時(shí)他們也指出蓮霧中的β-石竹烯對(duì)雌蟲具有明顯的引誘作用；施偉等(2009)選取馬切蘇芒和三年芒的完全成熟和未成熟果實(shí)對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行趨性測(cè)試，結(jié)果表明桔小實(shí)蠅對(duì)2種完全成熟芒果的趨性更加明顯，同時(shí)β-石竹烯均可在測(cè)試芒果中鑒定出來；王澤槐等(2010)在網(wǎng)室中測(cè)試了番石榴完全成熟果和腐爛果對(duì)桔小實(shí)蠅性成熟雌蟲的引誘作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腐爛果對(duì)桔小實(shí)蠅的誘集作用要顯著高于完全成熟果，而β-石竹烯也可在2種番石榴中鑒定出來。然而，上述研究人員均未指出桔小實(shí)蠅寄主選擇的偏好是否與β-石竹烯濃度存在相關(guān)性。事實(shí)上我們進(jìn)一步分析他們的揮發(fā)物鑒定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，上述研究中桔小實(shí)蠅嗜好寄主中β-石竹烯的含量均要低于桔小實(shí)蠅非嗜好的寄主。施偉等(2009)發(fā)現(xiàn)完全成熟芒果對(duì)桔小實(shí)蠅的引誘作用要大于未成熟芒果，而β-石竹烯在未成熟果的含量要遠(yuǎn)高于成熟果[三年綠硬芒(含量：1.67)VS三年黃軟芒(含量：0.93)；馬切蘇綠硬芒(含量：3.31)VS馬切蘇黃軟芒(含量：0.50)]；另外，王澤槐等(2010)發(fā)現(xiàn)β-石竹烯在番石榴完全成熟果中的含量也要遠(yuǎn)高于腐爛果[完全成熟果(含量：12.21)VS腐爛果(含量：1.44)]。結(jié)合我們的研究結(jié)果，我們認(rèn)為桔小實(shí)蠅對(duì)不同品種，成熟度和腐爛與否寄主的選擇偏好可能跟這些不同寄主中β-石竹烯濃度的不同具有相關(guān)性。

在害蟲防治的方法中有一種通過控制害蟲行為的推拉策略，即在作物田內(nèi)，利用行為調(diào)控物質(zhì)驅(qū)離害蟲；在作物田外或田邊，則利用引誘物質(zhì)吸引害蟲，并將害蟲集中消滅(Cooketal., 2007)。桔小實(shí)蠅對(duì)不同濃度β-石竹烯表現(xiàn)出的不同反應(yīng)則為田間桔小實(shí)蠅的防治提供了一種新的思路，可在實(shí)蠅寄主所在地放置一些高濃度β-石竹烯釋放裝置從而提高寄主周邊β-石竹烯的濃度，但在稍遠(yuǎn)離寄主的位置則可放置β-石竹烯濃度(例如，9 μg/mL)剛好合適的誘集裝置，從而形成一個(gè)對(duì)桔小實(shí)蠅的推拉系統(tǒng)來誘集桔小實(shí)蠅雌成蟲，但該策略是否可行還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并優(yōu)化。