邢喜平 王虎平 (甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 73000；甘肅中醫(yī)藥大學(xué))

在世界各國人口老齡化的快速推進(jìn)，阿爾茨海默病(AD)已嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量和生命健康〔1〕。因此，AD發(fā)病機(jī)制、治則治法、藥物開發(fā)已成為世界醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。前期我們基于“從肝脾論治AD”〔2〕的科研假說開展了逍遙散、黑逍遙散干預(yù)AD的相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔1，3～16〕并取得了一定的進(jìn)展。本研究將從追本溯源、精簡配伍的角度基于干預(yù)β-淀粉樣蛋白(Aβ)代謝的級聯(lián)靶效探討菖蒲四逆散對AD模型大鼠自由基氧化、膽堿神經(jīng)遞質(zhì)、學(xué)習(xí)記憶的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料 70只3月齡SPF級Wistar大鼠，雌、雄各半，體重(200±20)g，由蘭州畜醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物場提供，許可證號：SCXK(甘)2015-0001；菖蒲四逆散各組成藥物(石菖蒲、柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草)、青霉素(160萬U，批號：F6057301，華北制藥股份有限公司)、鹽酸多奈哌齊(批號：1604043，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司)均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；Aβ25～35(批號：20160509)購于上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；Rat淀粉樣前體蛋白(APP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)KIT(批號：1069820)、Rat Aβ1～42ELISA KIT(批號：1069821)、Rat乙酰膽堿(Ach)ELISA KIT(批號：1069818)、Rat膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)ELISA KIT(批號：1069819)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒(批號：20161218)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20161221)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：20161221)、考馬斯亮蘭蛋白測試盒(批號：20161220)均購自南京建成生物化學(xué)試劑有限公司；大鼠腦立體定位儀(型號：WT-200)、Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(型號：WMT-100)均為成都泰盟科技有限公司提供；酶標(biāo)分析儀(型號：DNM-9602)，北京普朗新技術(shù)有限公司；紫外分光光度計(jì)(型號：UV-120-02)，日本島津。

1.2動物分組與造模 70只SPF級Wistar大鼠(雌雄各半)于SPF級實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后水迷宮測試學(xué)習(xí)記憶能力，剔除不合格大鼠。合格大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，并按《大鼠腦立體定位圖譜》〔17〕進(jìn)行海馬CA1區(qū)注射，其中隨機(jī)選取10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組注射生理鹽水2 μl，其余皆注射Aβ25～35溶液(濃度為10 μg/μl)2 μl造模。術(shù)后碘伏擦拭傷口、涂青霉素粉末10萬U并每天肌肉注射青霉素10萬U，連續(xù)7 d。第8天以水迷宮測試造模大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，篩選造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為模型組、菖蒲四逆散低、中、高劑量組、陽性藥組各10只。

1.3藥物配制與給藥 菖蒲四逆散各組大鼠對應(yīng)生藥量以《方劑學(xué)》〔18〕中四逆散(柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草各6g)和《中藥學(xué)》〔19〕中石菖蒲(10 g)的常用劑量作為成年人中劑量、2倍為高劑量、1/2為低劑量換算得到，分別為0.34、0.68、0.17 g/(100 g·d)，灌胃水煎液皆濃縮為2 ml/(100 g·d)。

陽性藥組：安理申以蒸餾水配制成濃度為0.045 mg/ml的溶液。

造模第7 d開始給藥干預(yù)，模型組與假手術(shù)組大鼠灌胃生理鹽水2 ml/(100 g·d)，菖蒲四逆散低、中、高劑量組及陽性藥組大鼠分別灌胃各組對應(yīng)藥液2 ml/(100 g·d)，連續(xù)28 d。

1.4Morris水迷宮測試學(xué)習(xí)記憶〔1〕

1.4.1定位航行實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮分為四個(gè)象限，逃生平臺放置于固定象限。測試時(shí)將大鼠從各象限的固定入水點(diǎn)放入，其入水后尋找到平臺的時(shí)間即為逃避潛伏期。若在2 min內(nèi)沒有找到平臺，則記為120 s。共歷時(shí)4 d，每天更換入水象限測試。

1.4.2空間探索實(shí)驗(yàn) 迷宮實(shí)驗(yàn)第5天撤走逃生平臺，任選1個(gè)象限放入大鼠，讓其憑記憶尋找原逃生平臺位置。記錄其首次經(jīng)過原平臺位置的潛伏時(shí)間及120 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)，計(jì)算分析其在原平臺象限的游泳時(shí)間百分比。

1.5SOD、MDA、Ach、ChAT、AchE、APP、Aβ1～42測定 腹主動脈采血并分離血清，比色法測定血清SOD、AchE活性及MDA水平，ELISA測定血清Ach含量及 ChAT活性；分離腦組織海馬并加生理鹽水制成10%的勻漿，ELISA測定海馬勻漿APP、Aβ1～42含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1動物死亡情況 28 d給藥干預(yù)中，模型組、假手術(shù)組各死亡2只，陽性藥組死亡3只，菖蒲四逆散低劑量組死亡2只，高劑量組死亡1只。

2.2Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組、菖蒲四逆散各組大鼠逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，高劑量組明顯優(yōu)于低、中劑量組(P<0.05)；在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比均明顯延長(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期、在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比、首次到達(dá)原平臺位置潛伏期

與模型組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與高劑量組相比：3)P<0.05，4)P<0.01；與中劑量組比較：5)P<0.05；下表同

2.3Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠首次到達(dá)原逃生平臺位置的潛伏時(shí)間明顯延長，穿越原逃生平臺位置次數(shù)較少，在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、菖蒲四逆散各劑量組大鼠首次到達(dá)原平臺位置的潛伏期明顯縮短、穿越原平臺位置的次數(shù)均明顯提升，在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比均明顯增多(P<0.01)，且中、高劑量組在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。見表2。

組別n首次到達(dá)原平臺位置潛伏期(s)穿越原平臺位置次數(shù)(次)在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比(%)模型組837.62±19.131.75±1.3919.54±5.31假手術(shù)組817.32±1.982)4.63±1.772)40.30±10.482)陽性藥組719.42±4.791)4.14±1.072)40.02±8.162)菖蒲四逆散 低劑量組822.55±9.341)3.57±1.242)27.34±9.301)3)5) 中劑量組1023.03±5.371)3.26±1.112)38.85±9.742) 高劑量組921.45±8.561)4.08±1.372)39.08±10.212)

2.4對AD模型大鼠海馬APP、Aβ1～42含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬APP、Aβ1～42含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、菖蒲四逆散各組大鼠海馬組織Aβ1～42、APP含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表3。

2.5對AD模型大鼠血清SOD活性、MDA水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清SOD活性顯著降低，MDA水平明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、菖蒲四逆散各劑量組大鼠血清SOD活性增強(qiáng)，MDA水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)，且高劑量組大鼠MDA水平明顯低于中、低劑量組(P<0.01)。見表3。

2.6對AD模型大鼠血清Ach水平與ChAT、AchE活性的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清Ach水平與ChAT活性明顯降低，AchE活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、菖蒲四逆散各劑量組大鼠血清Ach含量明顯提高，ChAT活性明顯增強(qiáng)，AchE活性明顯減弱(P<0.05，P<0.01)。見表3。

組別nAPP(pg/mg)Aβ1～42(pg/mg)Ach(mmol/L)ChAT(U/ml)AchE(U/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)模型組885.52±12.74141.32±23.523.63±0.34220.38±31.648.98±1.4344.86±8.076.67±0.84假手術(shù)組840.13±8.222)78.53±17.552)8.21±0.562)316.40±40.252)6.29±1.752)112.31±5.842)3.60±0.332)陽性藥組748.33±9.872)82.40±16.982)6.16±0.392)281.91±19.421)6.17±1.562)80.77±9.802)4.55±0.902)菖蒲四逆散 低劑量組861.08±11.421)3)92.13±18.482)4.27±0.531)3)278.35±29.521)6.88±1.421)3)76.24±9.031)6.15±0.581)4) 中劑量組1049.34±9.522)85.42±16.912)6.12±0.592)259.28±24.741)3)6.12±1.412)79.42±9.521)6.21±0.651)4) 高劑量組943.51±10.242)96.19±15.732)7.95±0.522)294.25±20.532)6.24±1.312)88.91±10.332)4.21±0.522)

3 討 論

AD與中醫(yī) “癡呆”、“呆門”、“呆病”等密切相關(guān)，常規(guī)認(rèn)為其本在腎，以腎精虧虛，髓海不足為主。而《素問·靈蘭秘典論》云：“肝者，將軍之官，謀慮出焉”，《素問·六節(jié)藏象論》云：“肝者，罷極之本，魂之居也?！薄峨y經(jīng)》云：“脾藏意與智”，《醫(yī)方類聚》云：“脾藏二神意與智，意不安，思無慮，神奪愚也”?？梢姡珹D與肝、脾關(guān)系密切，調(diào)和肝脾將是防治AD的重要思路〔2〕。

四逆散作為調(diào)和肝脾的基礎(chǔ)方，方中柴胡疏肝解郁，白芍養(yǎng)血柔肝，和里暖急，二藥相合，一氣一血，一散一收，補(bǔ)肝體而助肝用；枳實(shí)苦泄，理脾導(dǎo)滯，與柴胡相配，一肝一脾，一升一降，調(diào)肝脾而暢氣機(jī)；甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。全方柴胡、芍藥以治肝，枳實(shí)、甘草以治脾，四藥相配，疏理肝脾，寧魂益智。石菖蒲“開心孔，補(bǔ)五臟，通九竅，明耳目，出音聲”，使人“不忘，不迷惑”。如此配伍的菖蒲四逆散肝脾同調(diào)，邪正兼顧，則心啟竅開，耳聰目明，神魂自如，癡呆自除。

現(xiàn)代研究表明，APP作為一種細(xì)胞內(nèi)跨膜蛋白，在腦組織中表達(dá)最高〔20，21〕，其中極少數(shù)的APP在β-分泌酶作用下裂解成β-APPs與C99，C99在γ-分泌酶作用下裂解成Aβ40和Aβ42，其中Aβ42很容易聚集而形成AD的特征性病理之一老年斑(SP)。當(dāng)然，Aβ42還可破壞神經(jīng)元內(nèi)離子平衡和膽堿能系統(tǒng)，激發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，引發(fā)神經(jīng)軸突、突觸損傷，改變激酶/磷酸酶的活性，導(dǎo)致tau蛋白的過度磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)〔20，22，23〕。因此，APP、Aβ尤其Aβ42的大量堆砌將會通過破壞膽堿能系統(tǒng)、激發(fā)氧化應(yīng)激等多種機(jī)制、多種途徑促成AD的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，菖蒲四逆散可較好地改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對AD具有一定的干預(yù)效果，其可能與改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、提升抗自由基氧化能力、促進(jìn)Aβ的代謝等多種途徑及相互級聯(lián)影響有關(guān)，至于其深層機(jī)制有待進(jìn)一步探討。