錢麗麗 閆秀明 張慧 張改 (河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)系微免教研室，河南 鄭州 451191)

肝癌為全球病死率最高的惡性腫瘤，中國每年約有38.3萬人死于該病，其死亡數(shù)占世界肝癌死亡量的1/2，致死率僅次于肺癌居第二位〔1,2〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α涉及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖，不僅作為促炎細(xì)胞因子參與廣泛的人類疾病，包括炎癥性疾病，也可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展〔3,4〕。miRNA為19～25 個核苷酸組成的短鏈內(nèi)源性非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用〔5〕。大量研究報(bào)道，miR-370在肝癌中發(fā)揮抑制癌癥惡化的作用〔6〕，但其作用機(jī)制尚未完全清楚。叉頭框基因(Fox)廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞中，其中FoxO1為Fox基因家族中的一員〔7,8〕。研究報(bào)道，促進(jìn)FoxO1在肝癌中的轉(zhuǎn)錄可抑制肝癌的惡化〔9〕。本研究觀察TNF-α處理后HepG-2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲情況，并觀察過表達(dá)FoxO1、抑制miR-370、敲減FoxO1對HepG-2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞HepG-2購自美國模式菌種收集中心；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Corning公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞HepG-2培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到75%左右，用胰蛋白酶消化，每2 d傳代1次。

1.3細(xì)胞處理與分組 用TNF-α (20 ng/ml)處理肝癌細(xì)胞HepG-2 48 h，標(biāo)記為TNF-α組；pcDNA、pcDNA-FoxO1、anti-miR-con、anti-miR-370、anti-miR-370+si-con、anti-miR-370+si-FoxO1，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書操作步驟轉(zhuǎn)染至HepG-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后用20 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)48 h，分別標(biāo)記為TNF-α+pcDNA組、TNF-α+pcDNA-FoxO1組、TNF-α+anti-miR-con組、TNF-α+anti-miR-370組、TNF-α+anti-miR-370+si-con組、TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1組，實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效率。確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取適量對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染和(或)TNF-α處理的各組HepG-2細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取細(xì)胞RNA，檢測含量，然后以RNA為模板按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，檢測濃度。最后根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行FoxO1 mRNA和miR-370的檢測。用2-△△Ct法計(jì)算miR-370、FoxO1的表達(dá)水平。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染和(或)TNF-α 處理的各組HepG-2細(xì)胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清。取適量蛋白上清至EP管，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE后將蛋白條帶用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜；置于5 %脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3次，加入稀釋的Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加稀釋的酶標(biāo)Ⅱ抗，4 ℃ 孵育2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.6MTT實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染和(或)TNF-α 處理的各組HepG-2細(xì)胞，以2×103個細(xì)胞/孔接種于96微孔板中，在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。

1.7Transwell小室檢測細(xì)胞遷移侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染和(或)TNF-α 處理的各組HepG-2細(xì)胞以106個/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞融合度至80%，更換為無血清培養(yǎng)基過夜饑餓培養(yǎng)。培養(yǎng)液稀釋各組細(xì)胞密度至105個/ml，Transwell上室加入100 μl細(xì)胞，下室加入600 μl含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)12～18 h。取出上層小室，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，PBS洗滌2次，甲醇固定遷移細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡觀察遷移細(xì)胞，隨機(jī)選取3個視野拍照，計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Transwell上層小室內(nèi)鋪適量厚度的基質(zhì)膠，后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn) 采用在線靶基因預(yù)測庫target scan(http://www.targetscan.org/)檢測到miR-370與FoxO1 3′非編碼區(qū)(UTR)存在結(jié)合位點(diǎn)，為了驗(yàn)證這一預(yù)測，構(gòu)建FoxO1 3′UTR-WT(含F(xiàn)oxO13′UTR片段)和FoxO1 3′UTR-MUT(含F(xiàn)oxO1 3′UTR片段突變體)的熒光素酶報(bào)告載體，根據(jù)1.3方法分別將FoxO1 3′UTR-WT和FoxO1 3′UTR-MUT與miR-370 mimics和miR-con共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，標(biāo)記為miR-370組、miR-con組，培養(yǎng)24 h，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值，以兩者的比值評價(jià)FoxO1基因突變型和野生型的熒光素酶相對活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TNF-α促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與Con組相比，TNF-α組肝癌HepG-2細(xì)胞在48 h和72 h細(xì)胞OD值顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見表1。

組別OD490 nm24 h48 h72 h遷移細(xì)胞數(shù)(個)侵襲細(xì)胞數(shù)(個)Con組0.36±0.040.52±0.060.79±0.0884.74±8.5664.37±7.13TNF-α組0.42±0.030.71±0.051.24±0.06188.32±15.43140.38±9.74t/P值2.079/0.1064.214/0.0147.794/0.00210.167/0.00110.907/0.000

2.2TNF-α抑制FoxO1表達(dá) 與Con組相比，TNF-α組HepG-2細(xì)胞FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 Con組和TNF-α組肝癌細(xì)胞FoxO1蛋白的表達(dá)

表2 TNF-α對肝癌細(xì)胞FoxO1表達(dá)的影響

組別FoxO1 mRNAFoxO1蛋白Con組1.12±0.110.55±0.05TNF-α組0.45±0.310.26±0.03t/P值3.528/0.0248.614/0.001

2.3過表達(dá)FoxO1可抑制TNF-α對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用 與TNF-α+pcDNA組相比，TNF-α+pcDNA-FoxO1組HepG-2細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.001)。在處理后48 h和72 h細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.01)。見表3和圖2。

組別FoxO1蛋白細(xì)胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細(xì)胞數(shù)(個)侵襲細(xì)胞數(shù)(個)TNF-α+pcDNA組0.33±0.040.40±0.040.75±0.061.15±0.12175.63±17.94131.78±12.72TNF-α+pcDNA-FoxO1組0.86±0.030.37±0.030.58±0.050.84±0.0887.27±8.8369.59±7.47t/P值18.360/0.0001.039/0.3573.77/0.0203.723/0.0207.654/0.0027.302/0.002

2.4miR-370靶向FoxO1 運(yùn)用target scan庫預(yù)測miR-370與FoxO1的結(jié)合發(fā)現(xiàn)，miR-370與FoxO1 3′UTR序列中存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-370組的FoxO1野生型WT-FoxO1細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而突變型MUT-FoxO1細(xì)胞中熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。與miR-con組(0.56±0.05)相比，過表達(dá)miR-370組細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá)(0.27±0.03)顯著降低(P<0.05)，與anti-miR-con組(0.58±0.06)相比，anti-miR-370組細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá)(0.92±0.08)顯著升高(P<0.05)。圖3B。

2.5抑制miR-370可抑制TNF-α對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用 與TNF-α+anti-miR-con組相比，TNF-α+anti-miR-370組HepG-2細(xì)胞中miR-370表達(dá)顯著降低(P<0.001)，在處理后48、72 h細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.01)。見表5。

圖3 miR-370靶向FoxO1

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

組別WT-FoxO1MUT-FoxO1miR-con組1.03±0.111.07±0.11miR-370組0.42±0.061.11±0.13t/P值8.432/0.0010.407/0.705

組別miR-370細(xì)胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細(xì)胞數(shù)(個)侵襲細(xì)胞數(shù)(個)TNF-α+anti-miR-con組0.93±0.090.41±0.040.76±0.061.19±0.11174.74±15.56134.32±11.13TNF-α+anti-miR-370組0.23±0.020.39±0.030.55±0.050.89±0.09101.32±6.4380.75±5.81t/P值13.151/0.0000.693/0.5274.657/0.0103.656/0.0227.553/0.0027.390/0.002

2.6抑制miR-370和沉默F(xiàn)oxO1對TNF-α促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與TNF-α+anti-miR-con組相比，TNF-α+anti-miR-370組HepG-2細(xì)胞在處理后48和72 h細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與TNF-α+anti-miR-370+si-con組相比，TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1組HepG-2細(xì)胞在處理后48和72 h細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)。見表6。

組別細(xì)胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細(xì)胞數(shù)(個)侵襲細(xì)胞數(shù)(個)TNF-α+anti-miR-con組0.42±0.040.87±0.061.18±0.12185.37±17.49135.78±11.71TNF-α+anti-miR-370組0.36±0.030.56±0.051)0.78±0.081)81.27±8.531)62.59±7.641)TNF-α+anti-miR-370+si-con組0.39±0.030.59±0.050.79±0.0884.27±8.3865.55±7.37TNF-α+anti-miR-370+ si-FoxO1組0.40±0.040.83±0.062)1.02±0.122)145.72±11.082)113.44±12.582)F/P值1.500/0.28725.205/0.00010.776/0.00453.395/0.00038.415/0.000

與TNF-α+anti-miR-con組比較:1)P<0.05；與TNF-α+anti-miR-370+si-con組比較:2)P<0.05

3 討 論

TNF-α由巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等分泌的促炎因子，在人類多種疾病中發(fā)揮作用，包括腫瘤〔10〕。有研究報(bào)道，TNF-α在腫瘤中具有雙向的作用，其抗腫瘤作用或促腫瘤作用與TNF-α的濃度有很大關(guān)系，高濃度TNF-α可通過分泌特異性T細(xì)胞、破壞腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用，低濃度TNF-α可激活核細(xì)胞因子(NF)-κB信號通路發(fā)揮促腫瘤作用〔11,12〕。Hu等〔13〕報(bào)道，聚碳酸酯磁性微球?qū)NF-α具有強(qiáng)磁響應(yīng)性和高TNF-α負(fù)載濃度，且對異種植瘤的裸鼠體內(nèi)具有高抑制和抗腫瘤作用。雷一鳴等〔14〕在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α在肝癌組織中表達(dá)升高，且可通過上調(diào)芐氟素(BECN)1、微管相關(guān)蛋白(LC3B)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

miRNA在腫瘤中發(fā)揮腫瘤基因或腫瘤抑制基因的作用，這在國內(nèi)外均得到普遍認(rèn)可〔15〕。miR-370在腫瘤中的調(diào)節(jié)較復(fù)雜，蘭敏〔16〕報(bào)道，miR-370在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥中均具有調(diào)節(jié)作用，如在肝癌、口腔癌、膀胱癌中下調(diào)發(fā)揮抑癌作用，在甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌中上調(diào)發(fā)揮致癌作用，而在胃癌、肺癌中既具有上調(diào)作用也具有下調(diào)作用〔17〕。孫戈等〔18〕報(bào)道，miR-370在肝癌中表達(dá)顯著下調(diào)，且與肝癌的惡性指標(biāo)及生存率密切相關(guān)。Pan等〔19〕在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-370在肝癌組織中的表達(dá)顯著降低，且與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、分期及總體生存率顯著相關(guān)，提示，miR-370的水平可作為臨床評估的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-370可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，推測其可能與調(diào)控TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

FoxO1基因在機(jī)體各種組織器官中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程〔20,21〕。FoxO1在多種腫瘤中表現(xiàn)為下調(diào)，發(fā)揮抑癌作用，其中包括肝癌〔22,23〕。張國強(qiáng)等〔24〕在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LINC00598、FoxO1在肝癌中表達(dá)均異常降低，且可上調(diào)肝癌的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，提示LINC00598可抑制肝癌的惡化，其可能與順勢調(diào)控FoxO1的表達(dá)有關(guān)。Jiang等〔25〕在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，三氟拉嗪(TFP)可抑制肝癌細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G0/G1期和細(xì)胞凋亡，下調(diào)細(xì)胞遷移或侵襲的能力，且將FoxO1的細(xì)胞質(zhì)定位逆轉(zhuǎn)為核定位并增加其在核中的表達(dá)，敲低FoxO1可顯著逆轉(zhuǎn)TFP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，此外，TFP可增加FoxO1的核定位，提示上調(diào)FoxO1在肝癌中可發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FoxO1在肝癌的惡性進(jìn)程中發(fā)揮抑制作用，敲減FoxO1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。

綜上，miR-370可靶向FoxO1調(diào)控TNF-α對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，miR-370可能是肝癌的新靶標(biāo)。