徐廣凌, 張小怡, 王晨陽, 端木彥濤, 王幸幸, 李茹君, 從 梅*, 趙偉棟*

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 a. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院； b. 藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

癌癥是威脅人類健康的重大疾病，已成為全世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]?；熢诎┌Y的治療中起著非常重要的作用，是臨床治療癌癥不可或缺的方案之一。然而，由于化療藥物自身分子結(jié)構(gòu)的局限，在臨床應(yīng)用中面臨眾多挑戰(zhàn)[2]。如吉西他濱(Gem， Chart 1)，1996年經(jīng)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)，通過干擾DNA的合成發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，是治療晚期非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌的一線藥物，也可用于乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等惡性腫瘤的治療[3]。然而，吉西他濱極易被肝臟和血液中的脫氧胞苷脫氨酶(CDA)脫去4-位氨基生成無活性產(chǎn)物2，2′-雙氟脫氧尿嘧啶核苷(dFdU, Chart 1)，導(dǎo)致其在人體內(nèi)半衰期極短(<17 min)[3]。因此，臨床通常需持續(xù)的靜脈給藥或聯(lián)合用藥來維持其細(xì)胞毒性作用。然而，這又增加了藥物對(duì)身體正常組織器官的毒副作用，臨床表現(xiàn)為骨髓抑制、腎毒性、胃腸道反應(yīng)等[3]。此外，吉西他濱為親水性藥物，難以通過自由擴(kuò)散透過細(xì)胞膜，必須借助相應(yīng)的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(如hENT)將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞[3]。但這種轉(zhuǎn)運(yùn)體在多數(shù)病人(>65%)體內(nèi)表現(xiàn)為缺失或表達(dá)量低[4]，進(jìn)一步限制了吉西他濱的藥效。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)體問題也是腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱產(chǎn)生耐藥的主要原因之一[5]。

Scheme 1

Chart 1

為此，研究人員對(duì)吉西他濱的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾和改造，取得了一定進(jìn)展[6-7]。近年來，納米藥物遞送系統(tǒng)為克服吉西他濱類化療藥物存在的弊端提供了策略[8-9]。利用納米技術(shù)構(gòu)建的小分子化療藥物遞送系統(tǒng)，通過增加生物膜的通透性，控制藥物釋放，延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間，提高負(fù)載藥物生物利用度[10-11]；另外，腫瘤組織中血管豐富、血管壁間隙相對(duì)較寬、結(jié)構(gòu)完整性差、淋巴回流缺失，納米顆粒可利用腫瘤增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)(EPR)有效地蓄積于腫瘤區(qū)域，從而增強(qiáng)藥物在體內(nèi)分布的特異性，提高化療效果及降低毒副作用[9]。Doxil是一種PEG化阿霉素脂質(zhì)體，是最早批準(zhǔn)的用于臨床治療的納米藥物[12]。Doxil可延長(zhǎng)阿霉素的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，并增加其在腫瘤部位的濃度，從而降低在正常組織中的濃度。例如，Doxil可以顯著地降低阿霉素的心臟毒性，并在多種惡性腫瘤疾病的治療中表現(xiàn)出與阿霉素類似的抑瘤效果[13]。Abraxan是一種白蛋白和紫杉醇結(jié)合形成的納米顆粒，既能保持紫杉醇的腫瘤治療效果又能避免傳統(tǒng)紫杉醇制劑Taxol因助溶劑Cremophor El而引起的毒副作用。研究表明[14]，給予相同紫杉醇劑量的Abraxane和Taxol， Abraxane在腫瘤部位的濃度較Taxol更高，即Abraxane能通過EPR效應(yīng)更多的在腫瘤部位富集。

將藥物分子被動(dòng)地包裹在載體中，除少數(shù)可能產(chǎn)生的疏水相互作用或靜電作用，藥物分子和載體之間通常沒有較強(qiáng)的作用力使之連接。因此，大部分藥物載體存在藥物包裹率低、易滲漏的問題，在制劑貯存階段以及體內(nèi)循環(huán)時(shí)都有可能發(fā)生，特別是對(duì)于吉西他濱類極性藥物，很難直接將其包載在載體材料中構(gòu)建納米遞送系統(tǒng)。

基于上述研究，本文將戊炔酸或正庚酸和吉西他濱通過酰胺鍵偶聯(lián)獲得目標(biāo)化合物2a, 2b和3a, 3b(Scheme 1)，期望能發(fā)現(xiàn)一種制備親脂性吉西他濱衍生物的路線，并獲得高活性抗腫瘤的候選化合物，為臨床借助納米技術(shù)構(gòu)建高穩(wěn)定性、低毒性的藥物遞送系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SGWRX-4型顯微熔點(diǎn)儀；Bruker Ascend-400 MHz型核磁共振儀(CDCl3或CD3OD-d4為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker 7-Tesla FT-ICR型質(zhì)譜儀。

吉西他濱，>99%，阿法埃莎公司；1-羥基苯并三唑(HOBt)，99%，伊諾凱公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCl)， 99%，麥克林公司；其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1) 5′-OH保護(hù)的Gem類似物(1)的合成

在干燥的圓底燒瓶中加入Gem 263.0 mg(1.0 mmol)和DMF 4.0 mL，攪拌使固體溶解;依次加入叔丁基二甲基氯硅烷602.4 mg(4.0 mmol)和咪唑273.9 mg(4.0 mmol)，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC監(jiān)測(cè))。將反應(yīng)液緩慢傾至蒸餾水(30 mL)中，用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取，合并有機(jī)相，經(jīng)無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=二氯甲烷/甲醇=100/3，V/V)純化得白色粉末1，收率63.3%, m.p.118～120 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.68(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.34～6.31(m, 2H), 5.70(d,J=7.6 Hz, 1H), 4.34～4.26(m, 1H), 4.00～3.97(m, 1H), 3.90～3.88(m, 1H), 3.81～3.77(m,1H), 0.94～0.90(m, 18H), 0.11(m, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 165.8, 155.6, 140.6, 122.0(t,J=258.3 Hz, CF2), 95.1, 84.5～83.9(m), 80.9～80.8(m), 70.0～69.6(m), 60.1, 29.7, 25.8, 25.5, 18.3, 18.0, -4.75, -5.29, -5.46, -5.45; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H39N3O4F2Si2{[M+H]+}492.2525, found 492.2521。

(2) 2a， 2b的合成(以2a為例)

在冰浴條件下，依次向圓底燒瓶中加入THF 2.5 mL， 4-戊酸59.2 mg(0.6 mmol)， EDCl 192.0 mg(1.0 mmol)和HOBt 135.4 mg(1.0 mmol)，反應(yīng)30 min；加入中間產(chǎn)物1 244.2 mg(0.5 mmol)，攪拌下繼續(xù)反應(yīng)24 h。旋蒸除溶，殘余物用水(15 mL)溶解，用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取，合并有機(jī)相，經(jīng)無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：B=乙酸乙酯/石油醚=1/2，V/V)純化得化合物2a。

以正庚酸代替戊炔酸，用類似的方法合成2b。

2a： 白色固體，收率33.0%, m.p.97～99 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.43(br s, 1H), 7.60(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.43(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.35～6.32(m, 1H), 4.36～4.30(m, 1H), 4.05～3.95(m, 2H), 3.83～3.80(m, 1H), 2.75(t,J=7.0 Hz, 2H), 2.59～2.55(m, 2H), 2.02(t,J=2.8 Hz, 1H), 0.96(s, 9H), 0.91(s, 9H), 0.14～0.11(m, 12H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 172.1, 163.1, 154.8, 144.1, 122.9(t,JC-F=259.5 Hz, CF2), 97.2, 85.1～84.4(m), 82.3, 81.5～81.4(m), 69.6～69.2(m), 59.9, 53.4, 36.1, 25.9, 25.5, 18.3, 18.0, 14.0, -4.8, -5.3, -5.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H43N3O5F2Si2{[M+Na]+}594.2607, found 594.2603。

2b： 白色固體，收率51.0%, m.p.49～51 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.08(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.34～6.30(m, 1H), 4.37～4.29(m, 1H), 4.03～3.95(m, 1H), 3.83～3.79(m, 2H), 2.48(t,J=7.4 Hz, 2H), 2.36(t,J=7.4 Hz, 2H), 1.68～1.63(m, 4H), 0.95(s, 9H), 0.90～0.87(m, 15H), 0.13～0.10(m, 12H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 179.4, 174.2, 163.0, 144.5, 123.1 (t,JCF=258.9 Hz, CF2), 96.7, 81.5～81.4(m), 69.7～69.2(m), 59.9, 37.6, 34.2, 31.4, 28.8, 28.7, 25.8,25.4, 24,8, 2.7, 22.5, 22.4, 18.3, 17.9, 14.0, -4.8, -5.3, -5.5; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H52N3O5F2Si2{[M+H]+}604.3414, found 604.3411。

(3) 3a, 3b的合成通法

在干燥的圓底燒瓶中加入中間產(chǎn)物2a或2b 113 mg(0.20 mmol), TBAF 0.50 mL(0.50 mmol)和超干THF 3.0 mL，攪拌下反應(yīng)20 min。濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得產(chǎn)物3a或3b。

3a： 白色固體，收率58.1%, m.p.147～149 ℃;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.35(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.26(t,J=7.2 Hz, 1H), 4.34～4.26(m, 1H), 3.99～3.94(m, 2H), 3.83～3.79(m, 1H), 2.69(t,J=7.2 Hz, 2H), 2.54～2.50(m, 2H), 2.28(t,J=2.6 Hz, 1H);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 173.8, 164.8, 157.7, 146.0, 124.0(t,J=257.5 Hz, CF2), 98.3, 86.9～86.2(m), 83.3, 82.9～82.8(m), 70.4, 70.2～69.9(m), 60.3, 37.1, 14.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H15N3O5F2{[M+Na]+}366.0877, found 366.0872。

3b： 白色固體，收率55%, m.p.116～118 ℃;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.33(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.26(t,J=7.2 Hz, 1H), 4.34～4.26(m, 1H), 3.99～3.94(m, 2H), 3.83～3.79(m, 1H), 3.31～3.30(m, 1H), 2.45 (t,J=7.6 Hz, 2H), 1.68～1.62(m, 2H), 1.42～1.28(m, 6H), 0.91(t,J=7.0 Hz, 3H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 176.0, 164.9, 157.7, 146.0, 125.2(t,J=257.2 Hz, CF2), 98.3, 86.8, 86.2, 82.9～82.8(m), 70.4, 70.2～69.7(m), 60.3, 38.2, 32.7, 29.9, 26.0, 23.7, 14.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H23N3O5F2Si2{[M+Na]+}:398.1503, found 398.1499。

1.3 生物活性測(cè)試

(1) 體外抗腫瘤活性

將腫瘤細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，注入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約6000個(gè)細(xì)胞。置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，于37 ℃， 5%CO2條件下過夜培養(yǎng)。先用DMSO將測(cè)試化合物溶解到合適濃度，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋到預(yù)設(shè)濃度。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)基置換成含50 μM有效吉西他濱藥物濃度的培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的含藥培養(yǎng)基置換成100 μL的CCK-8稀釋液(增強(qiáng)型CCK-8試劑盒，Beyotime Biotechnology, #C0042)， 37 ℃于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，即刻用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度A值。設(shè)置相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力。用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基將合成的化合物作系列濃度稀釋(50 μM, 5 μM, 2.5 μM, 0.5 μM, 0.05 μM)，以上述CCK-8試劑盒測(cè)定藥物各濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性，使用GraphPad Prism 7.0軟件，采用非線性曲線擬合方法計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)生長(zhǎng)抑制率IC50值。

(2) 酶穩(wěn)定性

用微量移液槍分別取150 μL含吉西他濱(100 μM)溶液或吉西他濱類似物3a(100 μM)的Tris-HCL緩沖溶液(pH 7.5, 50 mM)，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后在每個(gè)孔中加入50 μL濃度為0.005 μg/μLCDA酶(Abcam #99441)，混勻后振蕩2 min。使用酶標(biāo)儀在280 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定每孔在反應(yīng)開始后第1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 20 min, 45 min時(shí)的吸光度值[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性

采用CCK-8法對(duì)化合物2a， 2b， 3a和3b的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，在高測(cè)試濃度下(50 μM)，化合物2a和2b對(duì)人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa2， SW1990， PANC-1和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞均無抑制活性。化合物3b與吉西他濱Gem表現(xiàn)出相似的腫瘤細(xì)胞抑制活性。化合物3a在MiaPaCa2， SW1990， MCF-7中均表現(xiàn)出較Gem更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞抑制活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(T-test)證實(shí)兩組結(jié)構(gòu)差異顯著，P值分別為0.025， 0.044和0.035(圖1)。

圖1 目標(biāo)化合物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的抑制活性Figure 1 Biological activities of target compounds on the four tumor cells

由圖1還可知，3a藥物組中MiaPaCa2， SW1990， PANC-1， MCF-7等4種細(xì)胞的活力分別為(10.35±1.34)%， (9.91±1.37)%， (32.41±5.33)%， (15.22±1.53)%，而對(duì)照組的4種細(xì)胞的活力分別為(19.01±2.08)%， (20.13±3.24)%， (35.72±2.78)%， (23.20±2.02)%。在PANC-1細(xì)胞中，3a較Gem表現(xiàn)出更高的細(xì)胞抑制率，但T-test結(jié)果顯示差異不顯著(P=0.61)。

此外，還測(cè)得3a對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的IC50值均小于Gem組(表1)。而3b也顯現(xiàn)出與原藥吉西他濱相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型藥物Gem在N4引入親脂性功能基團(tuán)以后，有望保持或更好地發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。

表1 化合物的體外抗腫瘤活性Table 1 In vitro antitumor activities of the compounds

2.2 代謝穩(wěn)定性

文獻(xiàn)[3]報(bào)道吉西他濱臨床應(yīng)用面臨最嚴(yán)重的挑戰(zhàn)是其極易被血液中大量存在的CDA氧化失活，導(dǎo)致代謝穩(wěn)定性差。為探究3a表現(xiàn)出高抗腫瘤活性的原因，選擇3a和吉西他濱測(cè)定了CDA穩(wěn)定性(圖2)。由圖2可見，3a的吸光度與CDA無關(guān)聯(lián)，而吉西他濱在CDA存在條件下的吸光度顯著低于無酶條件下的吸光度，證明吉西他濱易被CDA還原而不穩(wěn)定，而3a則不受CDA影響，表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

Time/min圖2 Gem和3a對(duì)CDA的穩(wěn)定性Figure 2 The stabilities of Gem and 3a in the presence of CDA

借助羧酸類化合物，合成了具備高代謝穩(wěn)定性的脂溶性吉西他濱衍生物(2a, 2b和3a, 3b)。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，3a和3b具有抗腫瘤活性，尤其3a不僅在多個(gè)細(xì)胞系上顯現(xiàn)出強(qiáng)于吉西他濱的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，而且能對(duì)抗脫氧胞苷脫氨酶的作用，有望作為Gem的脂溶性前藥進(jìn)行深度開發(fā)。