鄭林波， 趙孔娥, 朱芳芳, 胡曉松

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

伴隨著蛋白質(zhì)科學(xué)研究的快速發(fā)展，天然氨基酸因其攜帶的功能基團(tuán)有限，無(wú)法滿(mǎn)足化學(xué)、生物學(xué)研究對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能日益增長(zhǎng)的特定要求。非天然氨基酸可以通過(guò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)賦予它們多樣性功能基團(tuán)，從而具備如熒光性能、光敏特性、氧化還原活性。非天然氨基酸已經(jīng)在酶活性測(cè)試、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)相互作用分析等方面發(fā)揮了一定作用[1-5]。例如，Peter等[6]實(shí)現(xiàn)了非天然氨基酸以基因編碼形式定點(diǎn)插入到蛋白質(zhì)中，制得具備某些特性的非天然氨基酸的設(shè)想。此外，非天然氨基酸也可以通過(guò)化學(xué)合成法、體外生物合成法等方式摻入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)[7]。

熒光探針已經(jīng)成為研究復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程的有力工具之一，具有良好熒光性質(zhì)且尺寸相對(duì)較小的非天然氨基酸熒光探針在生物學(xué)研究、病理研究等領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。二苯乙烯熒光團(tuán)具有π共軛有機(jī)體系，熒光量子產(chǎn)率較高，其物理、光學(xué)和電子性質(zhì)可通過(guò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)[8]，已被廣泛用于熒光探針的設(shè)計(jì)。Pradeep等[9]設(shè)計(jì)并合成了一系列含有二苯乙烯結(jié)構(gòu)的熒光非天然氨基酸，可以用作pH和氧化還原反應(yīng)刺激反應(yīng)型熒光探針。Ilseung等[10]用紫外線照射含有二苯乙烯結(jié)構(gòu)的無(wú)熒光的白藜蘆醇，獲得了一種新的、高熒光的光致異構(gòu)產(chǎn)物，可用于生物成像和雙光子顯微鏡。

氟原子具有核磁共振活性的同位素19F的自然豐度為100%，具有很高的核磁靈敏度，其化學(xué)位移與化學(xué)環(huán)境密切相關(guān)，而且天然蛋白質(zhì)中沒(méi)有氟原子存在導(dǎo)致的背景干擾，因此在氨基酸中引入氟原子后，可以利用它的氟譜研究含氟代氨基酸的蛋白質(zhì)在不同時(shí)間尺度上的動(dòng)態(tài)變化。

結(jié)合二苯乙烯熒光團(tuán)優(yōu)異的光學(xué)特性和氟原子的核磁探針屬性，在前期的二苯乙烯氨基酸的合成與性能研究的工作基礎(chǔ)上[11]，我們計(jì)劃在分子結(jié)構(gòu)中引入氟原子，使其可以同時(shí)作為熒光探針和核磁探針用于相關(guān)生物學(xué)研究。

本文首先通過(guò)對(duì)4-碘-L-苯丙氨酸(1)的羧基和氨基分別進(jìn)行保護(hù)得到甲基-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(4-碘苯基)丙酸酯(2)； 2與4-氟苯乙烯在3-苯基-2,4-戊二酮存在的情況下，通過(guò)Heck反應(yīng)得到甲基-(E)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(4-(4-氟苯乙烯基)苯基)丙酸酯(3)； 3首先在LiOH的作用下脫去酯保護(hù)基，然后在HCl作用下脫去叔丁氧羰基保護(hù)基得到(E)-2-氨基-3-(4-(4-氟苯乙烯基)苯基)丙酸的鹽酸鹽(4, Scheme 1)，產(chǎn)率47.4%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR、 IR和MS(ESI-TOF)確證。并研究了4的光學(xué)活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點(diǎn)儀；UV757CRT型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；Bruker AVANCE III 500 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Triple TOFTM5600型質(zhì)譜儀；G2-XS QTof型質(zhì)譜儀；WAY型阿貝折光儀；LS55型熒光/磷光/發(fā)光分光光度計(jì)；ZF-7A型紫外分析儀。

4-碘-L-苯丙氨酸(Ark Pharm)；亞硫酰氯(上海秦巴化工有限公司)；二碳酸二叔丁酯(Aladdin)；N-甲基嗎啉(Innochem)；醋酸鈀(Aladdin)； 4-氟苯乙烯(Accela)；N,N-二異丙基乙胺(上海秦巴化工有限公司)；3-苯基-2,4-戊二酮(TCI)；三苯基膦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 合成

(1) 2的合成

冰水浴冷卻下，將亞硫酰氯2.00 mL(27.40 mmol)緩慢滴加到1 1.60 g(5.50 mmol)的甲醇(10.00 mL)溶液中,滴畢，撤除冰水浴，回流反應(yīng)2 h。減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物用乙醚洗滌得白色固體4-碘-L-苯基丙氨酸甲酯，不經(jīng)純化直接使用。

向4-碘-L-苯丙氨酸甲酯的二氯甲烷(8.00 mL)溶液中依次加入N-甲基嗎啉1.82 mL(16.50 mmol)和二碳酸二叔丁酯1.58 g(7.14 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下反應(yīng)5 h。減壓蒸除溶劑，殘余物用乙酸乙酯(100 mL)溶解，依次用飽和碳酸氫鈉溶液(60 mL)，飽和食鹽水(60 mL)洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，收集濾液，蒸除溶劑得白色固體2 1.90 g，產(chǎn)率85.0%, Rf=0.50(石油醚/乙酸乙酯=3/1,V/V), m.p.75.1～76.9 ℃;1H NMRδ: 7.64(d,J=7.5 Hz, 2H), 7.30(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.06(d,J=8.0 Hz, 2H), 4.17～4.13(m, 1H), 3.61(s, 3H), 2.97～2.93(m, 1H), 2.82～2.77(m, 1H), 1.32(s, 9H);13C NMRδ: 172.35, 155.34, 137.41, 136.88, 131.55, 92.29, 78.30, 54.86, 51.82, 35.86, 28.07; IRν: 3346, 2964, 1738, 1686, 1526, 1441, 1367, 1291, 1252, 1222, 1166, 1057, 1002 cm-1; MALDI-TOF-MSm/z: Calcd for C15H20NO4I{[M+H]+}428.0329, found 427.9099。

(2) 3的合成

將N-(叔丁氧羰基)-4-碘-L-苯丙氨酸甲酯(2)405.23 mg(1.00 mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺和H2O的混合溶劑(DMF/H2O=1/1,V/V, 36 mL)中，加入3 mol%Pd(OAc)26.74 mg(0.030 mmol)，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)0.39 g(3.00 mmol)和6 mol%3-苯基-2,4-戊二酮10.3 mg(0.058 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入4-氟苯乙烯244.28 mg(2 mmol)，于90 ℃反應(yīng)4 h。加入乙酸乙酯100 mL，用飽和食鹽水(2×100 mL)，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V)純化得黃色固體3 245 mg，產(chǎn)率62.0%, Rf=0.35(石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V), m.p.99.3～100 ℃;1H NMRδ: 7.50～7.40(m, 4H), 7.13(d,J=7.32 Hz, 2H), 7.06(d,J=7.63 Hz, 2H), 7.05～6.99(m, 2H), 5.00(d,J=6.71 Hz, 1H), 4.65～4.54(m, 1H), 3.73(s, 3H), 3.24～3.10(m, 1H), 3.10～2.99(m, 1H), 1.44(br s, 9H);13C NMRδ: 171.26, 162.31, 154.06, 134.99, 132.50, 132.47, 128.66, 127.03, 126.97, 126.91, 126.38, 125.58, 114.69, 114.52, 78.96, 53.38, 51.22, 37.11, 27.29; IRν: 3361, 2983, 1749, 1687, 1599, 1514, 1444, 1367, 1304, 1165, 964, 542 cm-1; MALDI-TOF-MSm/z: Calcd for C23H26NO4F{[M+H]+}399.4624, found 399.4621。

(3) 4的合成

將化合物3 214 mg(0.54 mmol)溶于甲醇(4.0 mL)和四氫呋喃(12.0 mL)的混合溶劑中，于0 ℃緩慢滴加氫氧化鋰溶液14.0 mL(1.70 mmol)，滴畢，攪拌下反應(yīng)0.5 h(TLC檢測(cè))。滴加1 mol·L-1鹽酸至pH<3，蒸除有機(jī)溶劑，殘余物用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸除溶得白色粗品。不經(jīng)純化直接使用。

將粗品溶于1,4-二氧六環(huán)(6 mL)中，緩慢滴加12 mol·L-1鹽酸2 mL，滴畢，攪拌下反應(yīng)2 h(TLC檢測(cè))。旋蒸除溶，殘余物用二氯甲烷(2×40 mL)洗滌，蒸除溶劑得白色固體4 155 mg，產(chǎn)率90.0%, m.p.210～211 ℃;1H NMRδ: 7.68～7.62(m, 2H), 7.56(d,J=8.24 Hz, 2H), 7.29(d,J=8.24 Hz, 2H), 7.24(d,J=5.19 Hz, 1H), 7.22(s, 2H), 7.21～7.18(m, 1H), 4.14(t,J=6.41 Hz, 1H), 3.15～3.08(m, 2H);13C NMRδ: 170.20, 160.64, 135.93, 134.38, 133.62, 133.60, 129.88, 128.32, 128.26, 127.95, 127.93, 127.12, 126.55, 115.62, 115.45, 53.09, 35.38;19F NMRδ: -115.52; IRν: 3379, 3003, 2931, 1745, 1606, 1537, 1512, 1421, 1209, 1016, 962, 837, 696, 540 cm-1; MALDI-TOF-MSm/z: Calcd for C17H16NO2F·HCl{[M+H]+}322.1010, found 322.1015。

1.3 性能測(cè)試

(1) 熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定[12]

待測(cè)溶液為1.0 μmol·L-1化合物4的DMSO溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液為2.0 μmol·L-1硫酸奎寧的0.1 mol·L-1硫酸溶液。吸光度使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)試，利用熒光光譜儀測(cè)試溶液的發(fā)射光譜，然后計(jì)算發(fā)射峰積分面積。測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)溶液和DMSO的折射率分別為1.3452和 1.4778。

(2) 紫外-可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定

用甲醇配制50.0 μmol·L-1化合物4的溶液，然后取3 mL于10 mm×10 mm螺口石英比色皿中用于測(cè)定，將ZF-7A手提式紫外分析儀固定在桌面上，作為光源，發(fā)射254 nm的光，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要避開(kāi)自然光的照射。在環(huán)境溫度22 ℃下，照射比色皿中的溶液，光照一段時(shí)間后立即測(cè)定紫外-可見(jiàn)吸收光譜，并記錄光照時(shí)間；重復(fù)光照操作、測(cè)試，直至紫外可見(jiàn)-吸收光譜不再有明顯變化為止。

(3) 氟譜的測(cè)定

取化合物4 27.5 mg于10 mL樣品管中，加入5 mL氘代甲醇溶解配制成溶液，取氟譜內(nèi)標(biāo)三氟乙酸乙酯5 μL，加入1 mL氘代甲醇稀釋?zhuān)缓?，?50 μL內(nèi)標(biāo)溶液于已配制好的化合物4溶液中；最后，取3 mL加入內(nèi)標(biāo)之后的化合物4溶液于10 mm×10 mm螺口石英比色皿中用于測(cè)定，用固定在桌面上的ZF-7A手提式紫外分析儀作為激發(fā)光源發(fā)射254 nm的光，照射比色皿中的溶液。按設(shè)定的累計(jì)光照時(shí)間進(jìn)行照射，每到一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，取樣0.5 mL于核磁管中，立即測(cè)定氟譜，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避開(kāi)自然光的照射。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

初始原料為4-碘-L-苯丙氨酸，先后通過(guò)甲酯化保護(hù)羧基，叔丁氧羰基(Boc)酰胺化保護(hù)氨基，得到4-碘-L-氨基酸衍生物(化合物2)。原料中含有碘原子，可通過(guò)Heck反應(yīng)構(gòu)建二苯乙烯結(jié)構(gòu)的乙烯橋。Wittig反應(yīng)[13-14]、Heck偶聯(lián)反應(yīng)[15-16]和Suzuki反應(yīng)[17]是比較常用的幾種構(gòu)建乙烯橋的方法，但文獻(xiàn)[18-19]表明Heck 反應(yīng)產(chǎn)物的trans選擇性更好?；衔?是制備目標(biāo)產(chǎn)物重要的中間體，其分離純化可以通過(guò)甲醇重結(jié)晶進(jìn)行，總產(chǎn)率為85.0%。

二苯乙烯基熒光基團(tuán)的構(gòu)建通過(guò)化合物2與4-氟苯乙烯的Heck反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。本文使用醋酸鈀，3-苯基-2,4-戊二酮(配體)和N,N-二異丙基乙胺作為催化劑，產(chǎn)率較高(化合物3， 62.0%)，后處理簡(jiǎn)單，僅需硅膠柱層析分離(或乙酸乙酯重結(jié)晶)即可。當(dāng)使用本組前期工作所采用的以三苯基膦作配體，醋酸鈀、N,N-二異丙基乙胺作為催化劑的方案合成化合物3時(shí)，存在副反應(yīng)多，分離純化困難，產(chǎn)率較低(產(chǎn)率17.8%)等問(wèn)題，雖然此方法在苯乙烯與化合物2反應(yīng)制備二苯乙烯氨基酸時(shí)效果很好(產(chǎn)率81.0%)。此外，反應(yīng)體系的酸堿性以及配體、催化劑的用量都會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響，如果加入過(guò)量的配體，則容易使催化劑發(fā)生聚集，生成沒(méi)有催化活性的鈀黑，因此反應(yīng)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制好配體與醋酸鈀的比例。最后一步是將化合物3分別在堿性條件和酸性條件下，對(duì)羧基和氨基進(jìn)行脫保護(hù)即可得到目標(biāo)化合物4(產(chǎn)率90.0%)。化合物3和4的IR譜圖中在964和962 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，對(duì)應(yīng)的是反式烯烴結(jié)構(gòu)的=C—H面外搖擺振動(dòng)特征峰；在730～650 cm-1處沒(méi)有觀察到順式烯烴中的弱、寬吸收峰，這進(jìn)一步證實(shí)了雙鍵為反式結(jié)構(gòu)[20]。

2.2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜

圖1為化合物4的紫外-可見(jiàn)吸收譜圖。由圖1可知，化合物4在甲醇中吸收峰為296 nm和310 nm，在DMSO中的吸收峰為301 nm和315 nm。出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰的原因在于，分子內(nèi)存在不同類(lèi)型的電子躍遷。溶劑效應(yīng)的影響導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)和吸收強(qiáng)度產(chǎn)生了相應(yīng)變化。

λ/nm圖 1 化合物4的UV-Vis譜圖Figure 1 UV-Vis spectra of 4

2.3 熒光譜圖和熒光量子產(chǎn)率

圖2為化合物4在DMSO中的熒光激發(fā)、發(fā)射譜圖。由圖2可見(jiàn)，4的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為314 nm、 355 nm，斯托克斯位移為41 nm。當(dāng)乙烯基對(duì)位沒(méi)有氟原子取代時(shí)，其激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為312 nm、 357 nm，斯托克斯位移為45 nm[11]。表1為化合物4的物理化學(xué)性質(zhì)，其熒光量子產(chǎn)率為0.22，摩爾吸光系數(shù)為2.4×104cm-1·mol-1·L，當(dāng)乙烯基對(duì)位沒(méi)有氟原子取代時(shí)，該化合物的熒光量子產(chǎn)率為0.17，摩爾吸光系數(shù)為5.2×104cm-1·mol-1·L[11]。由此可見(jiàn)，氟原子的引入使熒光量子產(chǎn)率增加，改變了化合物的熒光性質(zhì)。

λ/nm

表 1 化合物4的物理化學(xué)性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of 4

λ/nm

2.4 光致順?lè)串悩?gòu)性

圖3為反式化合物4(50.0 μmol·L-1)甲醇溶液光致順?lè)串悩?gòu)隨光照時(shí)間變化的紫外-可見(jiàn)吸收譜圖。由圖3可見(jiàn)，未進(jìn)行光照射前，化合物4最大紫外吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在296 nm處，光照實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)，296 nm處的吸收峰迅速變?nèi)?。?dāng)累計(jì)光照時(shí)間t=14 min時(shí)，251 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，其強(qiáng)度隨著累計(jì)光照時(shí)間增長(zhǎng)而增強(qiáng)。當(dāng)t大于80 min時(shí)，紫外吸收光譜再無(wú)明顯變化，即累計(jì)光照時(shí)間t=80 min時(shí)達(dá)到光穩(wěn)態(tài)，此時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)等吸收點(diǎn)，分別位于251 nm和293 nm。在相同條件下測(cè)試乙烯基對(duì)位沒(méi)有氟原子取代的二苯乙烯氨基酸的光致順?lè)串悩?gòu)時(shí)，累計(jì)光照時(shí)間t=68 min時(shí)就達(dá)到了光穩(wěn)態(tài)，兩個(gè)等吸收點(diǎn)分別為253 nm和295 nm。

根據(jù)化合物4光致異構(gòu)轉(zhuǎn)變一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合曲線(曲線略)，由文獻(xiàn)[19]方法計(jì)算得到反式轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)速率常數(shù)k為0.026 min-1。前期工作對(duì)乙烯基對(duì)位沒(méi)有氟原子取代的二苯乙烯氨基酸的光致順?lè)串悩?gòu)轉(zhuǎn)變進(jìn)行了擬合[11]，計(jì)算得到k為0.046 min-1，這說(shuō)明在相同條件下，無(wú)氟取代的二苯乙烯類(lèi)氨基酸比有氟取代的二苯乙烯類(lèi)氨基酸(化合物4)具備更快的轉(zhuǎn)變速率。化合物4中由于氟原子的存在，其參與形成的氫鍵有可能使二苯乙烯結(jié)構(gòu)從反式轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖降幕罨茏兇?，?dǎo)致轉(zhuǎn)換速率降低。

2.5 光致順?lè)串悩?gòu)氟譜

圖4為化合物4隨光照時(shí)間變化的氟譜。從圖4可以看出，在未進(jìn)行光照之前，化合物4中氟原子的δ為-115.22，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的光照后，δ-115.53出現(xiàn)一個(gè)新峰，對(duì)應(yīng)的是順式異構(gòu)體中氟原子的峰。且隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)，新峰的強(qiáng)度也不斷增強(qiáng)。相對(duì)于核磁共振氫譜和碳譜，氟譜能夠更加清晰地反映順式/反式結(jié)構(gòu)的變化，因此化合物4可以作為核磁探針用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物學(xué)研究。

圖4 4因光致順?lè)串悩?gòu)隨光照時(shí)間變化的氟譜Figure 4 Light time-dependant 19F NMR spectra of compound 4 due to trans to cis photoisomerization

設(shè)計(jì)并合成了一種新型氟代二苯乙烯非天然氨基酸(化合物4)，斯托克斯位移為41 nm，激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為314 nm、 355 nm，產(chǎn)率為47.4%，熒光量子產(chǎn)率為0.22，具有較好的熒光性能?；衔?在甲醇溶液中存在光致順?lè)串悩?gòu)現(xiàn)象，擬合得到的反式轉(zhuǎn)變順式構(gòu)型的轉(zhuǎn)變速率常數(shù)為0.026 min-1。氟譜表明反式結(jié)構(gòu)和順式結(jié)構(gòu)中的氟原子的化學(xué)位移分別為-115.22和-115.53。因此我們可以通過(guò)光照來(lái)調(diào)控含有非天然氨基酸4的多肽或蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，并利用氟譜來(lái)研究這些大分子結(jié)構(gòu)中4的片段所含乙烯橋的構(gòu)象，從而可以探索這些大分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象與生理活性的關(guān)系。