郭雙，戴成球，金欽，張玉琴，許文*，黃鳴清*，林羽，徐偉

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

腦卒中又稱中風(fēng)，發(fā)病迅速，癥狀多樣，致殘率高，死亡率高，近年已成為導(dǎo)致死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅著人類的生命[1]。其中缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，是由于血管堵塞導(dǎo)致的大腦血流急劇減少甚至供應(yīng)中斷，繼而引發(fā)局部腦組織壞死，腦卒中在我國仍然是第一大致死性疾病[2]。

栝樓桂枝湯來源于張仲景的《金匱要略》，由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗六味藥組成，具有祛風(fēng)和營，生津柔筋之功用。陳立典教授結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗將栝樓桂枝湯應(yīng)用于腦卒中后的康復(fù)取得良好的療效，目前該方顆粒劑經(jīng)申報批準(zhǔn)為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑(批件號：閩 2013S0001)[3-4]。前期課題組開展了該方對海馬神經(jīng)細(xì)胞及中腦動脈閉塞(MCAO)模型大鼠的作用[5]，發(fā)現(xiàn)栝樓桂枝湯對缺血性腦卒中大鼠及原代海馬神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)作用與其抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，主要指特定時期內(nèi)由細(xì)胞、組織或生物體產(chǎn)生的所有小分子量代謝物總和[6]，它采用了系統(tǒng)生物學(xué)的策略和方法，基于疾病和藥物干預(yù)下的系統(tǒng)代謝網(wǎng)絡(luò)的整體性和動態(tài)性的變化，評價中藥復(fù)方的整體效應(yīng)及調(diào)控機制。本實驗在前期課題組對于栝樓桂枝湯血清藥物化學(xué)分析[7]及對腦缺血再灌注損傷的治療作用的研究基礎(chǔ)上，首次采用氣相色譜-高分辨率飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOF-MS)的大鼠血清代謝組學(xué)方法，通過分析栝樓桂枝湯對MCAO大鼠的內(nèi)源性化合物水平的影響，找出潛在的小分子生物標(biāo)志物，并建立栝樓桂枝湯治療缺血性腦卒中代謝途徑分析方法，為其對機體的整體作用效應(yīng)和分子調(diào)控機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境 健康成年雄性SD大鼠30只，SPF級，體質(zhì)量260～300 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：2007000509960，許可證號：SC-SCXK (滬)2012-0002。實驗動物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，溫度為22～24 ℃，相對濕度50%～70%；標(biāo)準(zhǔn)飼料及滅菌潔凈水；自由攝食飲水；每天定時更換墊料，保持干燥；光/暗周期12/12 h；醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施許可證號：SYXK (閩)2014-0005。

1.2 藥品與試劑 栝樓桂枝湯(院內(nèi)制劑，顆粒劑)；內(nèi)標(biāo)：L-2-氯苯丙氨酸(批號:103616-89-3，≥98%)，購自上海恒柏生物科技有限公司；衍生化試劑：BSTFA (含1% TMCS,V/V)，購自 Regis Technologies，Inc.；甲醇(色譜純，Merck公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司)；水為超純水，由Milli-Q純水系統(tǒng)制備(美國Milli-Q公司)。

1.3 主要儀器設(shè)備 GC色譜儀(Agilent 7890B,美國Agilent公司)；飛行時間質(zhì)譜儀(LECO Chroma TOF PEGASUS HT,美國LECO公司)；低溫高速離心機(Eppendorf公司)；高速渦旋儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 栝樓桂枝湯灌胃液的制備方法 取栝樓桂枝湯顆粒100 g，加入10倍量50%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液減壓蒸餾至無醇味，制得0.9 g·mL-1的栝樓桂枝湯提取液。根據(jù)人臨床用量換算成大鼠灌胃給藥劑量為每天3.6 g·kg-1[5]。

2.2 動物分組 實驗動物分為3組：假手術(shù)組(S組)、MCAO模型組(M組)、栝樓桂枝湯給藥組(T組)，每組10只，造模后1 h，灌胃給藥栝樓桂枝湯4 mL·kg-1，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，假手術(shù)組和模型組給予等容積的生理鹽水。

2.3 大鼠MCAO模型的建立 參考Longa和O Neil的方法[5]：禁食不禁水12 h的SD大鼠用10%水合氯醛麻醉后取仰臥位，取出頸前被毛、進(jìn)行常規(guī)消毒，頸部正中切口，仔細(xì)分離左側(cè)的頸總動脈(common carotid artery,CCA)，避免損傷迷走神經(jīng)及頸交感神經(jīng)，并向上分離頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)。在距離頸總動脈分叉較遠(yuǎn)處用醫(yī)用縫合線結(jié)扎總動脈和頸外動脈，將頸總動脈和頸內(nèi)動脈拉成一直線，用動脈夾暫時阻斷頸內(nèi)動脈血流，在頸總動脈血管壁上剪一小口，把粗細(xì)適中的線栓自頸總動脈切口插入，沿著頸總動脈分叉處緩慢插入頸內(nèi)動脈，遇有輕微阻力即可。此時線栓的膨大頂端即堵塞大腦中動脈的開口，再用縫合線固定住線栓，常規(guī)消毒后縫合皮膚切口。假手術(shù)組動物手術(shù)步驟類似，但未做線栓閉塞中動脈。造模后的大鼠輕輕轉(zhuǎn)移到鼠籠中，平躺在室溫墊料上以保持大鼠正常體溫。參照Longa評定法，進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評價，1～3分代表模型制作成功，可用于實驗。

2.4 樣品收集與前處理 各組動物取血離心，精密吸取50 μL血漿樣本，加入0.2 mL甲醇，再加入10 μL L-2-氯苯丙氨酸，漩渦混勻10 s；緊接著將樣本4 ℃，1 300 rpm離心15 min；小心地取出0.2 mL上清于2 mL進(jìn)樣瓶(甲烷硅基化的)中，每個樣本各取14 μL混合成QC樣本。在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入30 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg·mL-1)，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵30 min；向每個樣品中迅速加入40 μL BSTFA(含有1% TCMS，V/V)，將混合物70 ℃孵育2 h；冷卻至室溫，向混樣的樣本中加入10 μL FAMEs(飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液，溶于氯仿C8～C16：1 mg·mL-1；C18～C24：0.5 mg·mL-1)；混勻，上機檢測。

2.5 氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOF-MS)分析 GC-TOF-MS具體分析條件如下：進(jìn)樣量1 μL，不分流模式；載氣為氦氣；前進(jìn)樣口吹掃流速為3 mL·min-1；柱流速：1 mL·min；柱溫：50 ℃保持1 min，以每分鐘20 ℃的速率上升至300 ℃，保持6.5 min；前進(jìn)樣口溫度：280 ℃；傳輸線溫度：270 ℃；離子源溫度：220 ℃；電離電壓：-70 eV；掃描方式：m/z：50→500；掃描速率：20 spectra/sec；溶劑延遲：371 s。

2.6 數(shù)據(jù)處理 按照上述實驗條件，得到了大鼠血清中內(nèi)源性代謝物組的GC-TOF-MS數(shù)據(jù)，運用LECO公司的Chroma TOF 4.3X軟件和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫，對數(shù)據(jù)進(jìn)行原始峰測量、基線校準(zhǔn)、基線過濾、峰識別、峰對準(zhǔn)、峰面積積分等計算。使用SIMCA軟件(V14.1,MKS Data Analytics Solutions,Umea,Sweden)對歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量模式識別分析。數(shù)據(jù)經(jīng)多維統(tǒng)計后，找出的差異性代謝物，主要通過檢索NIST質(zhì)譜庫、HMDB數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/)比對、對照品庫比對等方法對生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血漿樣品GC-TOF-MS總離子流圖 在代謝組學(xué)中需要對大量樣品進(jìn)行分析，經(jīng)過分析大鼠血清樣品的代表性GC-MS總離子流圖如圖1所示。每種物質(zhì)的峰形良好，峰彼此分離很好，說明分析條件適用于本研究中樣品的檢測。

圖1 大鼠血清樣品的代表性GC-TOF-MS總離子流圖

3.2 多維統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

3.2.1 主成分(PCA)分析 色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過Chroma TOF 4.3X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取和前處理，使用SIMCA軟件進(jìn)行多元變量模式識別分析。為了考察MCAO造模造成的大鼠體內(nèi)代謝變化，首先采用了非監(jiān)督的PCA方法，PCA分析采用LOG轉(zhuǎn)換+CTR格式化處理的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，對數(shù)據(jù)進(jìn)行自動建模分析。

在PCA圖中，每一個點代表一個血漿樣品，樣品在空間分布不同代表不同組別樣本的代謝狀況。TOTAL PCA得分圖如圖2所示，結(jié)果表明組別之間的區(qū)分在得分圖上較為顯著，給藥組樣本在PCA得分圖空間上明顯從模型組向正常對照組方向回歸，樣本全部處于95%置信區(qū)間(Hotelling T2 ellipse)內(nèi)，累計的解釋率R2X=0.344 cum，Q2=0.013 8 cum。模型組與正常組、模型組與給藥組之間在PCA評分圖中顯示出清晰的區(qū)分，說明兩組別間的動物在代謝譜上有著顯著性的差異，PCA區(qū)分良好。

圖2 TOTAL PCA得分圖

3.2.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 與無監(jiān)督的PCA相比，有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)更關(guān)注在聚類中做出顯著貢獻(xiàn)的化合物，本實驗進(jìn)一步采用OPLS-DA來篩選假手術(shù)對照組、模型組和給藥組之間的差異代謝物。這種監(jiān)督的方法建立的模型，可以找到伴隨模型貢獻(xiàn)較大的代謝物變量，最大化地凸顯模型內(nèi)部與預(yù)測主成分(predictive component)相關(guān)的差異；M組對S組的OPLS-DA得分圖和置換檢驗圖如圖3所示。代表變量的分?jǐn)?shù)R2X和Q2Y是指模型解釋率和預(yù)測準(zhǔn)確程度，Q2Y的累計量都接近于1的時候，意味著模型比較理想，有很好的解釋率和預(yù)測率。本實驗得到的模型中Q2Y達(dá)到0.989，這說明模型的區(qū)分程度和預(yù)測程度都較好。置換檢驗R2=0.88可以體現(xiàn)出模型具有良好的穩(wěn)定性，從圖3中可以清晰地看到正常組樣本與模型樣本能完全分開，揭示缺血性腦卒中可導(dǎo)致大鼠的血清代謝組出現(xiàn)顯著代謝變化。同樣，從圖4中可以看出M組對T組的OPLS-DA得分下模型組和給藥組大鼠代謝譜能完全區(qū)分。模型的Q2Y達(dá)到了0.989，置換檢驗截距R2=0.843同樣體現(xiàn)出所建立的計算模型具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 M組對S組的OPLS-DA得分圖(A)和M組對S組的置換檢驗圖(B)

圖4 M組對T組的OPLS-DA得分圖(C)和M組對T組的置換檢驗圖(D)

3.3 差異代謝物的篩選及鑒定 為了找到與各組別動物高度相關(guān)的代謝物，通過OPLS-DA分析過濾掉了不相關(guān)的正交信號，獲得OPLS-DA載荷圖，見圖3～4。圖上每一個點代表了樣本中檢測到一個代謝物，距離原點越遠(yuǎn)，表示與主成分的差異越大，對組間的分類貢獻(xiàn)越大，載荷圖的左右兩端物質(zhì)可視引起兩組分類差異的主要代謝物，即為潛在的差異標(biāo)志物。以第一主成分的VIP值(Variable Importance in the Projection,卡值標(biāo)準(zhǔn)VIP>1)，學(xué)生氏t檢驗(Student′s t-test)的P值(P-value，P<0.05)來尋找差異代謝物，并通過檢索NIST質(zhì)譜庫、HMDB數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca)比對、對照品比對等方法對差異代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)指認(rèn)，鑒別出這13個差異代謝物見表1。

表1 GLGZD治療的缺血性腦卒中相關(guān)的代謝標(biāo)志物及其代謝途徑

3.4 代謝通路分析 首先將13個差異代謝物通過KEGG、PubChem等常用代謝物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行映射；接下來選擇大鼠(rattus norvegicus)物種數(shù)據(jù)庫搜索，最后進(jìn)行代謝通路富集和拓?fù)浞治觯猛贩治鰣D見圖5。其中，X軸(pathway impact)代表通路拓?fù)浞治鲇绊懸蜃?，Y軸[-log(P)]代表通路富集分析的P值(取負(fù)對數(shù))。與此同時，圓圈大小與顏色深淺分別表示通路拓?fù)浞治鲇绊懥χ岛屯犯患治鯬值(取負(fù)對數(shù))；圓圈越大，拓?fù)浞治鲇绊懥υ酱?；顏色越?越紅)，P值越?。环粗嗳弧Ｈ鐖D5所示，結(jié)果表明苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、色氨酸代謝、嘧啶代謝和甘油磷脂代謝是其重要的相關(guān)代謝途徑。

圖5 代謝通路分析

4 討論

4.1 栝樓桂枝湯對能量代謝的影響 大腦是碳水化合物和氧氣的主要消耗者，且大腦中無長期的能量儲存，需要持續(xù)供應(yīng)氧氣和葡萄糖來提供能量消耗，因此極易受到血液供應(yīng)不足的影響。缺血性腦卒中引起的腦缺血阻斷了大腦中氧氣和葡萄糖的供應(yīng)，破壞了三羧酸(TCA)循環(huán)，繼而導(dǎo)致大腦的能量供應(yīng)模式從有氧代謝轉(zhuǎn)向無氧代謝[8-10]。結(jié)果表明MCAO模型大鼠在給予與GLGZD治療后代謝物中葡萄糖-1-磷酸鹽、海藻糖 6-磷酸、4-乙酰丁酸、N(α)-芐氧羰基-L-亮氨酸含量明顯升高，促進(jìn)淀粉和蔗糖的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，增加缺血、缺氧條件下的能量代謝，同時代謝物吲哚乙酸含量明顯增高、丙二酸含量降低；吲哚乙酸是色氨酸的代謝分解產(chǎn)物，提示GLGZD可能通過促進(jìn)蛋白質(zhì)、氨基酸分解代謝來增加能量供應(yīng)，而丙二酸是競爭性抑制劑，對電子傳遞鏈中的琥珀酸脫氫酶(復(fù)合物Ⅱ)起作用，丙二酸下降可降低對能量供應(yīng)的抑制[11]。

4.2 栝樓桂枝湯對脂質(zhì)代謝的影響 神經(jīng)元膜富含多不飽和脂肪酸，對自由基的攻擊特別敏感，而缺血再灌注損傷可導(dǎo)致膜脂質(zhì)氧化；其中乙醇胺作為神經(jīng)元中N-酰基-磷脂酰乙醇胺的氧化降解產(chǎn)物，可反應(yīng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙和神經(jīng)元損傷[12-13]。如表1所示，在本實驗中給藥組中的乙醇胺相較之模型組呈下降趨勢，說明給藥組的神經(jīng)元損傷較輕。肉豆蔻酸是存在于動物中的一種飽和14-碳脂肪酸，可摻入到真核細(xì)胞質(zhì)膜的磷脂雙層的脂?；诵?，參與并賦予酶的膜定位[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)給藥組中的肉豆蔻酸較之模型組明顯升高，提示GLGZD可通過提升細(xì)胞膜的恢復(fù)能力來減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。

4.3 栝樓桂枝湯對氨基酸代謝的影響 鳥氨酸參與許多代謝途徑，它是尿素循環(huán)的核心部分，可以處理過量的氮氣；本實驗中發(fā)現(xiàn)給藥組中鳥氨酸含量下降，提示GLGZD可促進(jìn)鳥氨酸運輸?shù)骄€粒體中，減少鳥氨酸在細(xì)胞質(zhì)中的積累和提高清除氨甲酰磷酸和氨負(fù)荷的能力來減輕神經(jīng)損傷[15]。在本研究中，與MCAO組相比，GLGZD干預(yù)后發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸、β-氨基異丁酸等氨基酸代謝物水平增加或減少，改善了腦缺血再灌注損傷引起的氨基酸代謝異常[16]。

綜上，本實驗首次基于GC-TOF-MS的大鼠血清代謝組學(xué)分析方法探討栝樓桂枝湯對缺血再灌注大鼠治療作用的代謝組學(xué)機制研究，利用多元統(tǒng)計分析PCA和OPLS-DA方法，揭示大鼠血清中內(nèi)源性小分子化合物的模式變化規(guī)律，篩選并鑒定出吲哚乙酸、丙二酸、乙醇胺、肉豆蔻酸、鳥氨酸等13個具顯著差異性的代謝物，可視為GLGZD對MCAO大鼠發(fā)揮治療作用的生物標(biāo)志物，并且栝樓桂枝湯對缺血性腦卒中的保護(hù)作用主要反應(yīng)可能在能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝等代謝途徑的變化，通過促進(jìn)糖轉(zhuǎn)化、蛋白氨基酸分解代謝來增加能量供應(yīng)；提升細(xì)胞膜的恢復(fù)能力、提高清除氨甲酰磷酸和氨負(fù)荷的能力等來減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善大鼠腦缺血再灌注損傷癥狀。

致謝：本研究在康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心資助下完成。