蒙 濤，駱 璽，王 強(qiáng)

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

糖尿病所致的血管內(nèi)皮功能障礙引起的糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死、致殘的重要原因，尋找有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物對(duì)防治糖尿病具有重要意義[1]。中醫(yī)經(jīng)典方劑金芪降糖片由黃連、黃芪和金銀花3味中藥配伍而成，具有降血糖、保護(hù)血管和改善糖尿病血管并發(fā)癥的作用[2]。雖然金芪降糖片在糖尿病血管并發(fā)癥的治療方面頗有成效，但其成分復(fù)雜、活性多樣的特點(diǎn)，使其作用機(jī)制尚未闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，從整體和系統(tǒng)的角度去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，闡明藥物作用機(jī)制[3]，其系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)與中醫(yī)中藥整體觀、辨證論治的原則不謀而合，目前己被廣泛應(yīng)用到中醫(yī)藥研究領(lǐng)域[4-5]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，旨在探討金芪降糖片保護(hù)血管的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 黃芪降糖片有效成分的獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得黃連、黃芪、金銀花已知的化學(xué)成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和Caco-2滲透性(Caco-2≥0.40)為參數(shù)，篩選出活性較高的化合物[6]，獲取化合物PubChem CID，并從化合物的“Related targets”中獲得其對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得到的化合物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行矯正統(tǒng)一。

1.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將矯正后的化合物靶點(diǎn)基因名稱上傳到CTD(http：//ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用其自身的Set Analyzer分析工具，設(shè)置P-value≤0.01，對(duì)靶基因進(jìn)行疾病聚類(Enriched Diseases)，在結(jié)果中選擇Vascular Diseases，篩選出保護(hù)血管關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)GO注釋及通路分析

利用Cytoscape軟件的GlueGO工具，對(duì)篩選出的血管保護(hù)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO (gene ontology) 生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG (KEGG pathway analysis)通路注釋分析，設(shè)定閾值P<0.05，選取具有顯著性差異的所有通路。

1.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用軟件 Cytoscape 3.6.1，根據(jù)上述收集到的化合物及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)、通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)圖中，化合物、靶點(diǎn)、通路等信息用節(jié)點(diǎn)(Node)表示，化合物與其潛在作用靶點(diǎn)、靶點(diǎn)參與的疾病均以邊(edge)相連。以節(jié)點(diǎn)大小表示節(jié)點(diǎn)度(degree)，節(jié)點(diǎn)的度(degree)值越大，則這個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分、靶點(diǎn)或通路越有可能是作用機(jī)制中的關(guān)鍵點(diǎn)。

1.5 有效指數(shù)計(jì)算

以有效指數(shù)(Er)評(píng)價(jià)化合物對(duì)通路的作用效果，篩選出金芪降糖片保護(hù)血管的關(guān)鍵通路。

注：NT為該化合物作用的靶點(diǎn)總數(shù)，NTP為該化合物作用的靶點(diǎn)中參與該條通路的靶點(diǎn)數(shù)目，NP為該條通路的靶點(diǎn)總數(shù)。

1.6 整合通路構(gòu)建

根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，將活性成分作用靶點(diǎn)的基因名稱導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，利用KEGG mapping工具，將靶點(diǎn)映射到對(duì)應(yīng)通路獲取通路圖，得出金芪降糖片保護(hù)血管的關(guān)鍵作用機(jī)制。

1.7 活性成分與靶蛋白分子對(duì)接

利用Sybyl 1.0軟件對(duì)關(guān)鍵通路對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算，以驗(yàn)證關(guān)鍵靶蛋白與對(duì)應(yīng)化合物的結(jié)合活性。在PDB (http：//www.rcsb.org/pdb/)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中下載含有原配體的靶蛋白晶體結(jié)構(gòu)及其配體結(jié)構(gòu)。利用PubChem CID，在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并下載對(duì)應(yīng)金芪降糖片活性化合物的3D結(jié)構(gòu)(sdf格式)，之后利用ChemDraw 3D將sdf格式的化合物文件轉(zhuǎn)換為mol2格式文件。運(yùn)用Sybyl軟件中的SurFlex-Dock模塊，選定靶蛋白中的原配體小分子藥物結(jié)合位點(diǎn)為活性中心，采用總分(Total Score)函數(shù)作為打分函數(shù)，進(jìn)行對(duì)接計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲得黃連、黃芪、金銀花目前已知成分48、87、236 種，具有較好口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和Caco-2滲透性(Caco-2≥0.40)的化合物分別為黃連9種、黃芪12種、金銀花10種，其中24個(gè)化合物預(yù)測(cè)與115個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 金芪降糖片成分篩選結(jié)果

續(xù)表1

No.PubChemCIDMolecule NameOB (%)Caco-2DL相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)來(lái)源M226436722phytofluene43.182.290.500金銀花M235280489beta-carotene37.182.250.5822金銀花M245281235kryptoxanthin47.251.690.570金銀花M256371716Ethyl linolenate46.101.540.202金銀花M265282184Mandenol42.001.460.193金銀花M275280794Stigmasterol43.831.440.7631金銀花M2811870462ZINC0397878143.831.320.760金銀花M29222284beta-sitosterol36.911.320.7538金銀花M305380108All-trans-Rhodoxanthin31.221.170.550金銀花M3110970376Corymbosin51.960.880.4126金銀花

2.2 CTD篩選及ClueGO分析結(jié)果

由CTD篩選出血管保護(hù)核心靶點(diǎn)49個(gè)，見(jiàn)表2。由ClueGO分析，49個(gè)核心靶點(diǎn)最相關(guān)的通路和生物過(guò)程(前15個(gè))，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，這些基因主要參與循環(huán)系統(tǒng)中的血管過(guò)程(Vascular process in circulatory system)、調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)(Regulation of calcium ion transport)、調(diào)節(jié)血管直徑(Regulation of blood vessel diameter)等生物過(guò)程。在KEGG通路中，這些基因涉及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥相關(guān)的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)等信號(hào)通路。

2.3 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圖2為金芪降糖片成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，其中包含了66個(gè)節(jié)點(diǎn)和229條邊。66個(gè)節(jié)點(diǎn)中包括21個(gè)化合物，30個(gè)潛在靶點(diǎn)和15條通路。由網(wǎng)絡(luò)圖可知，化合物 M23、M29和M13具有較大節(jié)點(diǎn)度(degree)值，是金芪降糖片主要活性成分，PTGS2、NOS3和NOS2相鄰化合物節(jié)點(diǎn)最多，分別有多個(gè)活性化合物與之結(jié)合。

圖1 GlueGO分析結(jié)果

表2 CTD篩選結(jié)果

圖2 金芪降糖片成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.4 有效指數(shù)計(jì)算分析和通路圖獲取

活性化合物對(duì)相關(guān)通路的有效指數(shù)Er計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖3，計(jì)算值越大說(shuō)明化合物對(duì)該通路作用越強(qiáng)。有效指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示，金芪降糖片活性化合物對(duì)VEGF信號(hào)通路作用最強(qiáng)，其中化合物M23對(duì)多條通路均有顯著作用。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，利用KEGG mapping工具，將參與VEGF信號(hào)通路的金芪降糖片活性化合物相關(guān)靶點(diǎn)映射到VEGF信號(hào)通路獲取通路圖，得到金芪降糖片保護(hù)血管核心作用機(jī)制，見(jiàn)圖4。

2.5 分子對(duì)接計(jì)算分析

以分子對(duì)接計(jì)算，驗(yàn)證金芪降糖片活性化合物與VEGF信號(hào)通路相關(guān)靶蛋白的結(jié)合活性。根據(jù)有效指數(shù)Er計(jì)算結(jié)果，篩選出對(duì)VEGF信號(hào)通路活性最高的10個(gè)化合物，與對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶蛋白CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，4個(gè)靶蛋白均有2個(gè)或2個(gè)以上的化合物對(duì)接打分接近或者超過(guò)原配體小分子，顯示金芪降糖片活性化合物對(duì)上述靶蛋白具有較好的結(jié)合活性。

圖3 有效指數(shù)計(jì)算結(jié)果

注：紅色為金芪降糖片活性化合物潛在作用靶點(diǎn)圖4 VEGF信號(hào)通路

表3 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

金芪降糖片對(duì)糖尿病所致的血管并發(fā)癥具有較為顯著的治療作用，針對(duì)中藥及其復(fù)方研究局限性的限制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析金芪降糖片保護(hù)血管的分子機(jī)制。本研究收集到金芪降糖片24個(gè)活性化合物可能作用于115個(gè)靶蛋白，其中49個(gè)核心靶點(diǎn)(表2)涉及血管病變，這提示金芪降糖片活性化合物可能是通過(guò)作用于這49個(gè)核心靶點(diǎn)保護(hù)血管。通過(guò)ClueGO分析生物過(guò)程富集(圖1)發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片保護(hù)血管的活性成分潛在作用靶點(diǎn)在循環(huán)系統(tǒng)中的血管過(guò)程、調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)血管直徑等生物過(guò)程富集，這些生物學(xué)過(guò)程紊亂很可能是病理性血管損傷的原因，同時(shí)表明金芪降糖片可能通過(guò)改善這些生物過(guò)程發(fā)揮其保護(hù)血管的作用。KEGG通路富集(圖1)以及“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(圖2)分析發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片保護(hù)血管的活性成分潛在作用靶點(diǎn)參與糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥相關(guān)的蛋白聚糖、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路，這些通路異常也是糖尿病血管病變的誘因，同時(shí)也有大量文獻(xiàn)證實(shí)金芪降糖片通過(guò)調(diào)控這些通路發(fā)揮其保護(hù)血管的作用。

高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，引發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥的重要原因。尹登科等[7]研究證實(shí)，黃連多糖能顯著減少高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)的表達(dá)，降低AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活作用，進(jìn)而改善AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。血液流體剪切應(yīng)力異常也是誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂的重要因素。當(dāng)歸補(bǔ)血湯由當(dāng)歸和黃芪配伍而成，秦臻等[8]研究證實(shí)，增大當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪的比例，可促進(jìn)低血液流體剪切應(yīng)力作用下受損內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS表達(dá)和NO分泌，進(jìn)而顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)。這些研究結(jié)果充分顯示出金芪降糖片調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號(hào)通路，改善血液流體剪切應(yīng)力異常，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，與本文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果一致。

根據(jù)活性化合物對(duì)相關(guān)通路的有效指數(shù)Er計(jì)算結(jié)果(圖3)分析發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片活性化合物對(duì)VEGF信號(hào)通路作用最強(qiáng)，其中涉及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、半胱氨酸蛋白酶9(CASP9)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、一氧化氮合酶(NOS3)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)等5個(gè)靶點(diǎn)。根據(jù)VEGF信號(hào)通路圖(圖4)的信息以及查閱的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)參與VEGF信號(hào)通路的5個(gè)金芪降糖片活性化合物作用的靶點(diǎn)在糖尿病血管病變中發(fā)揮著重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能有效誘導(dǎo)血管再生，王興木等[9]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平隨著病變的加重而顯著增加，這表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。此外，VEGF也能通過(guò)影響下游靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能。Xu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF過(guò)表達(dá)可影響PI-3K/AKT/m-TOR/eNOS和p38/MAPK信號(hào)，進(jìn)而改善棕櫚酸誘導(dǎo)的糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。PI3K/AKT/mTOR磷酸化活化后，促進(jìn)細(xì)胞周期，加速細(xì)胞增殖[11]。AKT磷酸化可促進(jìn)eNOS磷酸化催化產(chǎn)生NO[12]，適量的NO 分泌可保護(hù)血管內(nèi)皮功能，而過(guò)量的NO分泌則會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變，致使內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，引起血管內(nèi)皮損傷[13]。P38/MAPK信號(hào)通路則通過(guò)調(diào)節(jié)膠原纖維蛋白原和纖溶酶原活性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架重組[14]。NO和PGI2是VEGF信號(hào)下游的分子，分別由eNOS和PTGS2催化產(chǎn)生，F(xiàn)edorowicz等[15]研究證實(shí)，NO和PGI2依賴的機(jī)體功能受損是糖尿病主動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙的重要因素。這些研究結(jié)果提示金芪降糖片活性化合物可能通過(guò)作用于上述靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路，進(jìn)而保護(hù)血管，改善糖尿病血管并發(fā)癥。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，金芪降糖片活性化合物具有改善VEGF信號(hào)，進(jìn)而保護(hù)血管的作用。鄭凝等[16]發(fā)現(xiàn)金芪降糖片具有抑制RAGE表達(dá)，降低腎組織VEGF、TGF-β1、CTGF 水平的作用。封芬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素治療可促進(jìn)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈PI3K、Akt 和eNOS等蛋白表達(dá)，證實(shí)黃連素可能是通過(guò)激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑，改善糖尿病血管內(nèi)皮功能。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示(表3)，金芪降糖片活性化合物黃連素(M2)、表小檗堿(M5)、β-胡蘿卜素(M23)和十八碳二烯(M26)分別與2個(gè)或2個(gè)以上的靶蛋白對(duì)接打分接近或者超過(guò)原配體小分子，顯示出對(duì)VEGF信號(hào)通路靶蛋白具有較好的結(jié)合活性，這提示這4個(gè)化合物可能是金芪降糖片調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路的主要活性化合物。其中，黃連素分子對(duì)接結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討并揭示了金芪降糖片保護(hù)血管的主要成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)生物信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)分析推測(cè)金芪降糖片活性化合物主要通過(guò)作用于VEGF、CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2等5個(gè)靶點(diǎn)，影響VEGF信號(hào)通路，從而起到保護(hù)血管的作用，其中發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性化合物可能是黃連素、表小檗堿、β-胡蘿卜素和十八碳二烯。本研究為進(jìn)一步深入探討金芪降糖片保護(hù)血管的作用機(jī)制提供借鑒。