劉最，李玉中，何麗芳

（衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421008）

色素即著色劑，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、印染等工業(yè)。通常分為合成色素和天然色素兩大類。由于合成色素色澤鮮艷、著色力強、價格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，被廣泛使用。隨著人們安全意識的增強，對食品要求也愈發(fā)提高，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)合成色素具有一定的慢性毒性和致癌性[1-2]。與之相比，天然色素源于自然，安全性高、且無毒無副作用。同時，天然色素不僅具有一定的營養(yǎng)價值，還具有良好的保健和藥用功能，如番茄紅素有利于降低得癌癥和心血管病等慢性病的機率[3]；姜黃素具有抗誘變、抗腫瘤、抗氧化、降血脂和抗動脈粥狀硬化，以及抗炎、抗凝、抗感染、防止老年斑的形成等多種生理功能[4]；花青素具有抗氧化、清除自由基的作用，并兼具抗癌、降血壓、軟化血管等方面的功能性[5]；蝦青素具有強抗氧化、抗炎癥、免疫力調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[6-7]；靈菌紅素具有提高白細胞活性，促進其吞噬效應(yīng)或者誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌細胞凋亡的作用[8-9]。已逐漸取代合成色素，在世界范圍內(nèi)受到積極開發(fā)。微生物色素作為一種天然色素，具有易于培養(yǎng)，發(fā)酵周期短，不受季節(jié)、空間和環(huán)境影響等優(yōu)于動植物色素的多種特點[10-11]。因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然色素具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，利用微生物生產(chǎn)天然色素的種類較多，研究主要集中在藍色素、紅色素、紫色素、黃色素等[12-15]。而關(guān)于綠色素的研究主要是植物資源，如：芹菜、菠菜、綠茶等，對通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)綠色素的報道卻甚少。

放線菌作為一類具有重要經(jīng)濟價值的微生物資源，廣泛存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境之中，與人類關(guān)系極其密切。它可以產(chǎn)生多種抗生素及包含維生素、酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗寄生蟲劑和天然食用色素在內(nèi)的多種非抗生素類活性物質(zhì)[16]。本研究以分離自吉林省四平市大棚黑土中的一株鏈霉菌PTY-3 作為實驗材料，通過發(fā)酵培養(yǎng)，研究多種單因素對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響，以及在單因素的基礎(chǔ)上利用正交試驗法對鏈霉菌PTY-3 高產(chǎn)綠色素的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為其產(chǎn)綠色素進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

從吉林省四平市大棚黑土樣品中分離純化得到編號為PTY-3 的鏈霉菌菌株，由衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

均采用高氏一號培養(yǎng)基[17]。

1.3 儀器與設(shè)備

BSD-yx2200 博訊智能精密搖床 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-BSH-III 生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV-2102 PCS 型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SB-5200D 超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)

挑取適量的孢子，接種于裝有高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL 三角錐形瓶中， 于28 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)24 h 后，再接種至搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)液中，28 ℃，200 r/min，恒溫培養(yǎng)7 d。

1.4.2 色素檢測方法

將發(fā)酵液于5000 r/min 離心15 min，棄去上清液，得綠色菌體。在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，準確稱取一定量0.1 g 菌體于研缽中研磨成粉末，加入10 mL 無水乙醇，震蕩混勻，靜置2 h后，進行超聲提取，離心得綠色素浸提液，濃縮為綠色素粗提物[18]，待用。

色素效價定義[19]：每毫升發(fā)酵液所提取的色素，在最大吸收波長處測得的吸光度為0.1， 定義為1 個色價(U/mL)。

1.4.3 最大吸收波長的測定

將綠色素浸提液稀釋適當倍數(shù)，用UV-2102 PCS 型紫外可見分光光度計進行光譜掃描，以提取劑乙醇為空白對照，選取掃描波長為190-910 nm，確定其最大吸收波長。

1.4.4 單因素試驗

(1)初始pH 值對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

以種子培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，控制裝液量為100 mL，接種量為10 %，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為7 d，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH 值分別為5.5、6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 和8.5，以色價作為測量指標，觀察初始pH值對色素產(chǎn)生的影響。

(2)裝液量對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

以種子培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.5，設(shè)置搖瓶的裝液量分別為50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL、120 mL，其它發(fā)酵條件同上，以色價作為測量指標，觀察裝液量對色素產(chǎn)生的影響。

(3)接種量對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

以種子培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置裝液量為100 mL，控制搖瓶的接種量分別為2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %、14 %，其它發(fā)酵條件同上，以色價作為測量指標，觀察接種量對色素產(chǎn)生的影響。

(4)發(fā)酵溫度對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

以種子培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，控制接種量為10 %，調(diào)節(jié)發(fā)酵搖床的培養(yǎng)溫度分別為24 ℃、26 ℃、28 ℃、 30 ℃、32 ℃和34 ℃，其它發(fā)酵條件同上，以色價作為測量指標，觀察發(fā)酵溫度對色素產(chǎn)生的影響。

(5)發(fā)酵時間對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

以種子培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)搖床培養(yǎng)溫度為28 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)時間分別為5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d，其它發(fā)酵條件同上，以色價作為測量指標，觀察發(fā)酵時間對色素產(chǎn)生的影響。

1.4.5 正交試驗設(shè)計

以綠色素的色價為指標，分別研究了5 個因素對鏈霉菌PTY-3 發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)綠色素能力的影響。在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，數(shù)據(jù)結(jié)果運用excel2007 處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)觀察

如圖1 所示，菌株P(guān)TY-3 在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，24 h 后可見白色菌落，并伴有少量綠色素的產(chǎn)生。隨著時間的增加，菌落形態(tài)增大且綠色素產(chǎn)量增加。菌落干燥，表面呈致密的絲絨狀，與培養(yǎng)基連接緊密，難以挑取。正反面顏色不一致，氣生菌絲為灰白色，基內(nèi)菌絲呈現(xiàn)綠色。

2.2 最大吸收波長的確定

將菌株接種于高氏一號液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，利用超聲波法提取的綠色素溶液（乙醇為溶劑）如圖2 所示。

圖2 菌株產(chǎn)生的綠色素

以提取劑乙醇為空白對照，選取掃描波長為190-910 nm，綠色素的吸光特性見圖3。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，該綠色素溶液在波長為214 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰。

圖3 超聲波法提取的色素溶液光譜掃描

2.3 單因素對綠色素產(chǎn)生的影響

2.3.1 初始pH 值對產(chǎn)綠色素的影響

圖4 初始pH 值對產(chǎn)綠色素的影響

由圖4 可知，隨著pH 的升高，綠色素產(chǎn)量先增加后減少，發(fā)酵起始pH 值在5.5～7.5 范圍內(nèi)，綠色素的產(chǎn)量隨pH 值的增大而增加。pH 為7.5 時，綠色素的產(chǎn)量達到最高。pH 值超過7.5 之后，菌體的生長和產(chǎn)物的合成均受到一定的抑制，綠色素的產(chǎn)量隨著pH 值的增大而出現(xiàn)下降的趨勢。微生物在不同的生長階段和不同的生理生化反應(yīng)過程中有不同的最適pH 要求，因而在不同的pH 值條件下積累的代謝產(chǎn)物也會有所不同。結(jié)果表明在偏酸和偏堿的環(huán)境條件下，會影響酶的活性和微生物的代謝過程，也會影響微生物對物質(zhì)的利用情況，從而導(dǎo)致綠色素產(chǎn)量下降。因此最佳初始起始pH 值為7.5 時最有利于綠色素的合成。

2.3.2 裝液量對PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

圖5 裝液量對產(chǎn)綠色素的影響

裝液量在一定程度上反映了發(fā)酵液的溶氧量。鏈霉菌是好氧型生物，在液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，適量的溶解氧不僅可以促進菌株呼吸代謝的進行，還有利于代謝產(chǎn)物色素的合成。由圖5 可知，隨著裝液量的增加，綠色素的產(chǎn)量先緩慢增加再急劇下降。裝液量在50-100 mL 內(nèi)， 隨著搖瓶裝液量的增加，綠色素的產(chǎn)量隨之增加。在裝液量為100 mL 時達到最高，繼續(xù)增加裝液量綠色素產(chǎn)量則急劇下降。這是因為裝液量少、營養(yǎng)成分少，不利于綠色素的合成，產(chǎn)量則低；隨著裝液量的不斷增加，溶氧水平下降，不利于于菌體的生長。同時，代謝途徑可能會發(fā)生改變，產(chǎn)生其它類型的副產(chǎn)物，故綠色素的產(chǎn)量則呈不斷下降的趨勢。因此250 mL 的三角瓶裝液量為100 mL最有利于綠色素的合成。

2.3.3 接種量對PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

圖6 接種量對產(chǎn)綠色素的影響

接種量的大小決定菌株在液體發(fā)酵過程中的生長繁殖速度，會影響代謝產(chǎn)物的合成。由圖6 可知，接種量為2 %～14 %過程中，隨著接種量的增加，綠色素產(chǎn)量呈先增加后下降的趨勢。 接種量在2 %～10 %內(nèi)，綠色素產(chǎn)量隨接種量的增加而提高。在接種量為10 % 時達到最高，當接種量大于10 %時，綠色素的產(chǎn)量開始下降。原因在于，接種量過小，菌數(shù)增長緩慢，會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵效率，同時也會降低菌種活力。接種量過大，培養(yǎng)液粘度增加，引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟。適宜的接種量可以縮短微生物的適應(yīng)期，使之快速進入對數(shù)期，因此接種量為10 % 最有利于綠色素的合成。

2.3.4 發(fā)酵溫度對PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

圖7 發(fā)酵溫度對產(chǎn)綠色素的影響

由圖7 可知，發(fā)酵溫度在24～34 ℃內(nèi)，綠色素產(chǎn)量隨著溫度的升高先增加再下降。即當發(fā)酵溫度為24～28 ℃時，綠色素產(chǎn)量隨著溫度的升高而不斷增加。在28 ℃時，綠色素產(chǎn)量達到最高。溫度過高時，綠色素產(chǎn)量呈下降趨勢。原因可能是溫度不僅對微生物的酶促反應(yīng)速率和代謝調(diào)節(jié)途徑產(chǎn)生一定的影響，還可能會影響產(chǎn)物合成方向和發(fā)酵液的理化性質(zhì)（溶解氧的溶解度，基質(zhì)的分解和吸收速率、營養(yǎng)濃度等），最終導(dǎo)致綠色素的產(chǎn)量發(fā)生變化。因此發(fā)酵溫度為28 ℃最有利于綠色素的合成。

2.3.5 發(fā)酵時間對PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響

圖8 發(fā)酵時間對產(chǎn)綠色素的影響

由圖8 可知，發(fā)酵時間在5 ～8 d 內(nèi)，綠色素的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。達到8 d 后綠色素的產(chǎn)量不再增加，達到最高值。繼續(xù)延長發(fā)酵時間，綠色素的產(chǎn)量呈下降的趨勢。因為綠色素是發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵前期，主要是菌體的自我增殖，色素沒有產(chǎn)生，當菌體量不再增加時，則開始積累代謝產(chǎn)物。當發(fā)酵達到一定時間，菌體的部分死亡使發(fā)酵液成分發(fā)生變化，會引起pH 改變，從而影響色素的產(chǎn)生。所以發(fā)酵達到8 d 時綠色素含量達到最高。發(fā)酵時間超過8 d 后，次級代謝產(chǎn)物綠色素可能會發(fā)生某種程度上的降解或者轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌a(chǎn)物，因而綠色素產(chǎn)量不斷減少。因此最佳發(fā)酵時間為8 d 最有利于綠色素的合成。

2.4 正交試驗及驗證

在以上單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，按照表1 設(shè)計5 因素4 水平的正交試驗[20]，對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

表1 正交試驗因素水平

由表2 的極差分析可知，5 個因素對綠色素的色價影響大小順序依次為裝液量＞接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞起始pH 值。由表3 的方差分析可見，4 個因素均不顯著( p＞0.05)。因素D 在統(tǒng)計學(xué)上有顯著影響，而因素A、B、C 和E 沒有顯著影響。綜合分析，鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2D3E2，即發(fā)酵時間8 d，發(fā)酵溫度為28 ℃，接種量為10%，裝液量110 mL/250 mL和發(fā)酵起始pH 值為7.5。

根據(jù)優(yōu)化所得的最佳發(fā)酵條件組合，進行驗證實驗。綠色素平均產(chǎn)量為77.0 U/m L，基本符合預(yù)期值，綠色素產(chǎn)量相比優(yōu)化前提高了34.4 %，由此可見，不同培養(yǎng)條件之間存在一定的協(xié)同作用，對其優(yōu)化后明顯提高了色素的產(chǎn)量。正交試驗優(yōu)化所得組合A2B2C2D3E2，可以作為鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的最佳發(fā)酵條件。

表2 綠色素產(chǎn)量的正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

3 結(jié)論與討論

本實驗以一株產(chǎn)綠色素的鏈霉菌作為實驗菌株，分別研究了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、裝液量和發(fā)酵起始pH 值對鏈霉菌PTY-3 產(chǎn)綠色素的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了該菌株產(chǎn)色素的發(fā)酵條件。在最佳發(fā)酵條件下，綠色素產(chǎn)量高達77.0 U/m L，是未優(yōu)化前的1.34 倍。然而，該研究只是停留在實驗室階段，若要利用發(fā)酵罐加大培養(yǎng)的話，期間可能會遇到很多問題，下一步需以優(yōu)化后的發(fā)酵條件為前提，通過利用基因工程手段得到編碼色素合成酶的相關(guān)基因，構(gòu)建微生物色素生產(chǎn)工程菌，并對其代謝途徑進行有效調(diào)控，就有可能實現(xiàn)色素的工業(yè)化生產(chǎn)。

對于該菌株的分類地位尚未研究，需結(jié)合16S rRNA 序列分析進行確定。目前有關(guān)放線菌產(chǎn)綠色素的研究甚少，所以該菌株具有很好的應(yīng)用前景。為此，后續(xù)需要進一步對綠色素的安全性、穩(wěn)定性及生物活性等方面進行研究，并且采用化學(xué)分析測試方法對其結(jié)構(gòu)進行研究比較，為該色素在食品、醫(yī)藥、化妝品、印染等方面的應(yīng)用提供有益探索。