楊海，張淇美，龔慧芳，唐青海，陽希，岳躍飛

（1.衡陽師范學(xué)院 南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008；2.南岳生物制藥有限公司 湖南省血液制品工程技術(shù)研究中心，湖南 衡陽 421007）

我國是養(yǎng)豬大國，隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展和豬肉消費(fèi)的持續(xù)增加，豬血逐漸成為生豬集中屠宰加工過程中的重要副產(chǎn)物[1]。據(jù)估計(jì)，2019 年我國豬血產(chǎn)量約200 萬噸，由于深加工技術(shù)制約，大部分豬血用來直接食用或制作動物飼料等低附加值產(chǎn)品[2]，因此，豬血深加工技術(shù)越來越受到重視[3]。

球蛋白是一類具有抗體活性或結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白，是機(jī)體免疫作用和抗病能力中最關(guān)鍵、最直接的基礎(chǔ)性物質(zhì)，在人和動物疾病防治中發(fā)揮了重要作用。據(jù)報(bào)道，豬免疫球蛋白能有效治療輪狀病毒引起的嬰幼兒腹瀉[4]、家禽呼吸道疾病[5]，仔豬口服豬免疫球蛋白能顯著提高存活率[6]，在科研工作中則常常用來標(biāo)記抗原[7]。隨著人們對豬球蛋白功能的認(rèn)識不斷深化，豬球蛋白在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用逐漸鋪開，市場對豬球蛋白量與質(zhì)的需求越來越高，迫切需要對豬球蛋白的高效制備技術(shù)進(jìn)行研究。

從母豬初乳中可以提取到高質(zhì)量的豬球蛋白，但存在提取成本高、條件要求高、原料來源少等不足，難以規(guī)模化生產(chǎn)。豬血中的球蛋白含量高達(dá)2 %，而且產(chǎn)量豐富，成本低廉，因此，從豬血中提取球蛋白是實(shí)現(xiàn)豬球蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的可靠途徑[8]。目前，從豬血中提取球蛋白的方法有鹽析法、辛酸沉淀法、層析法、免疫吸附法、利凡諾法等，存在回收率低、純度低、成本高以及環(huán)境污染等不足[8-9]。

本研究旨在以新鮮豬血為原料，采用差速離心法獲得豬血漿，探索并確定豬血漿球蛋白制備過程中的血漿稀釋倍數(shù)、pH、乙醇濃度和溫度四個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，通過三次乙醇反應(yīng)和純化操作，從豬漿血中分離提取球蛋白，為豬血漿球蛋白的規(guī)?；苽涮峁﹨⒖?。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

檸檬酸三鈉、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、乙醇、氯化鈉、檸檬酸、醋酸、醋酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸均購自天津科密歐試劑公司，標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白購自Sigma 公司，豬球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自北京博爾西公司，蛋白Marker 購自賽默飛公司。

1.2 主要儀器

pH 計(jì)（優(yōu)特儀器有限公司，ECPH70042S）、低溫離心機(jī)（Eppendorf， 5920 R）、探針式溫度計(jì)（歐達(dá)時(shí)，TP500）、低溫恒溫槽(江蘇恒諾儀器有限公司，NDC-3020J）、全自動蛋白電泳分析儀（美國海倫娜公司，SPIFE4000）、可見分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司，UV2150）、磁力攪拌器、電熱恒溫水浴鍋等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 差速離心獲取血漿

新鮮豬血和3.8 %的檸檬酸三鈉按照9：1 比例混勻，4 ℃靜置30 min 后，4 ℃1000 r/min 離心30 min；取上清液，4 ℃3000 r/min 離心30 min，取上清液，得到清亮血漿。血漿分裝，于－20 ℃條件下保存。

1.3.2 蛋白濃度測定

采用雙縮脲法測定蛋白含量，具體操作為：將蛋白溶液與試劑按表1 混合，37 ℃水浴20 min，冷卻至室溫后，在紫外分光光度計(jì)（540 nm）上進(jìn)行檢測并獲得數(shù)據(jù)。

表1 豬血漿蛋白濃度配比

1.3.3 豬血漿球蛋白的制備

根據(jù)擬定的豬血漿球蛋白制備技術(shù)路線（圖1），將乙醇反應(yīng)分為三個(gè)階段，在低溫恒溫槽內(nèi)完成三次乙醇反應(yīng)：

圖1 豬血漿球蛋白制備技術(shù)路線

第一次乙醇反應(yīng)：用0.9 %的氯化鈉稀釋血漿至蛋白含量為5 %，1 mol/L 的檸檬酸調(diào)pH 至6.8-7.1，降溫至1.5 ℃-0.5 ℃；邊攪拌邊緩慢加入-15 ℃、95 %的乙醇，控制最終乙醇濃度為20 %（按每1000 毫升血漿制品加267 毫升95 %乙醇計(jì)算）；復(fù)測pH 并調(diào)制6.9-7.1，于-4.5 ℃至-5.0 ℃攪拌（反應(yīng)），-3.0 ℃至-5.0 ℃溫度下離心30 min，取沉淀。

第二次乙醇反應(yīng)：沉淀用-2 ℃-0 ℃、0.01 mol/L的氯化鈉溶解，定容至12-14 倍沉淀體積；沉淀充分溶解后，用pH4.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH 至5.4-5.6，降溫至-0.5 ℃--1 ℃；邊攪拌邊緩慢加入－20 ℃、95 %的乙醇，控制乙醇終濃度為14.5 %-15 %；復(fù)測pH 并調(diào)至5.4-5.5，-4.8 ℃至-5.3 ℃條件下攪拌（反應(yīng)）；-3.0 ℃至-5.0 ℃條件下離心30 min，取上清。

第三次乙醇反應(yīng)：每1 L 上清加入5 g 氯化鈉，控制乙醇濃度為18 %-20 %；用0.5 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)pH 至6.9-7.1；-5 ℃至-6 ℃條件下攪拌（反應(yīng)），-4.0 ℃至-6.0 ℃條件下離心30 min，沉淀即為球蛋白粗品。

蛋白純化：5 倍球蛋白粗品沉淀量、2-4 ℃的去離子水溶解沉淀；1 M/L 的醋酸調(diào)pH 至4.0 左右，澄清后過濾，收集沉淀；中空纖維超濾柱超濾脫醇；0.5 M/L 的鹽酸調(diào)pH 至3.6-3.7；調(diào)蛋白濃度至6-8 %，用7-8 ℃的去離子水連續(xù)6 次等體積透析，收集沉淀并凍干，于-20 ℃條件下保存。

1.3.4 豬血漿球蛋白的定性定量分析

采用SDS-PAGE 法進(jìn)行定性分析，即采用5 %濃縮膠、12 %分離膠，獲得SDS-PAGE 電泳圖，并于標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行比對。

取0.1 g 凍干后的粗蛋白沉淀，充分溶于100 mL 的純凈水中，利用全自動蛋白電泳分析儀完成蛋白定量檢測，直接獲取蛋白純度和含量數(shù)據(jù)，并采用SPSS11.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)蛋白的定性分析

SDS-PAGE 電泳圖譜分析可知，如圖2 所示，提取產(chǎn)物在56KD 和27kD 處出現(xiàn)標(biāo)志性條帶，與豬血漿球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品條帶大小一致，說明獲得物為豬血漿球蛋白。

圖2 球蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜

2.2 目標(biāo)蛋白的定量分析

全自動蛋白電泳分析儀獲得掃描圖像（圖3），結(jié)果顯示，豬血漿蛋白峰單一且集中，說明提取的蛋白具有較高的純度。

圖3 球蛋白電泳分析圖譜

2.3 第二階段稀釋倍數(shù)對球蛋白制備的影響

第二階段不同稀釋倍數(shù)對球蛋白提取的影響見表2。由表2 可知，當(dāng)?shù)鞍壮恋硐♂?2 倍時(shí)，球蛋白得率可以達(dá)到25.6 g，純度可以達(dá)到99.3 %，明顯高于稀釋倍數(shù)為17和22時(shí)的球蛋白得率和純度。

表2 第二階段不同稀釋倍數(shù)對球蛋白提取的影響

2.4 pH 對球蛋白制備的影響

乙醇反應(yīng)時(shí)，pH 對球蛋白提取的影響見表3、表4 和表5。

表3 第一階段乙醇反應(yīng)pH 對球蛋白提取的影響

由表3 可知，第一階段乙醇反應(yīng)，當(dāng)pH 為7.0時(shí)，球蛋白得率和純度最高，分別達(dá)到29.1 g 和97.2 %，顯著高于pH 為6.0 和6.5 時(shí)的球蛋白得率和純度，說明第一次乙醇反應(yīng)的適宜pH 為7.0。

表4 第二階段乙醇反應(yīng)pH 對球蛋白提取的影響

由表4 可知，第二階段乙醇反應(yīng)，當(dāng)pH 分別為4.5、5.0 和5.5 時(shí)，球蛋白得率沒有顯著差異，均超過24 g，但pH 為5.5 時(shí)的球蛋白純度顯著高于pH 為4.5 和5.0 時(shí)的球蛋白純度。

表5 第三階段乙醇反應(yīng)pH 對球蛋白提取的影響

由表5 可知，第三階段乙醇反應(yīng)，當(dāng)pH 為6.5和7.0 時(shí)，球蛋白得率沒有顯著差異，但均高于pH為6.0 時(shí)的球蛋白得率；pH 分別為6.0、6.5 和7.0時(shí)，球蛋白純度卻無顯著差異。

2.5 乙醇濃度對球蛋白制備的影響

第二階段乙醇濃度對球蛋白制備的影響見表6。

表6 第二階段乙醇濃度對球蛋白提取的影響

由表6 可知，第二階段乙醇濃度為15 %時(shí)，可以獲得較好的球蛋白得率和純度，乙醇濃度為10 %和20 %時(shí)，球蛋白得率和純度差異并不顯著，但低于15 %的乙醇濃度時(shí)，蛋白得率和純度則會顯著降低。

表7 第三階段乙醇濃度對球蛋白提取的影響

由表7 可知，第三階段乙醇濃度為18 %時(shí)，可以獲得較好的球蛋白得率和純度，高于18 %的乙醇濃度時(shí)，球蛋白得率和純度差異不顯著，但低于18 %的乙醇濃度時(shí)，球蛋白得率和純度則會顯著降低。

3 結(jié)論與討論

球蛋白是決定機(jī)體抗病能力的關(guān)鍵物質(zhì)，也是具有廣闊市場前景的生物藥物[10]。球蛋白可以從初乳、蛋黃等生物材料中提取，但存在成本高、條件要求高等不足。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展和生豬集中屠宰的推進(jìn)，豬血深加工逐漸成為一個(gè)行業(yè)熱點(diǎn)問題。免疫球蛋白占豬血漿蛋白總量的16.3 %，從豬血漿中提取球蛋白成為首選[11]。因豬血的成分復(fù)雜，脂蛋白含量高，提取其球蛋白方法不同程度地存在純度低、回收率低、分離效率低、成本高以及介質(zhì)殘留等尚待解決的問題，因此建立一套成熟的豬血漿球蛋白制備工藝，對于延長豬血產(chǎn)品附加值、減少屠宰環(huán)節(jié)污染、促進(jìn)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義。

低溫乙醇沉淀法是人血漿球蛋白制備的主要方法，其基本原理是：低溫狀態(tài)下，血漿中加入乙醇，借助乙醇較低的介電系數(shù)，奪取與溶質(zhì)結(jié)合的水分子，使蛋白質(zhì)分子間的吸引力增大，溶解度降低，繼而生成沉淀。低溫乙醇沉淀法用于制備豬血漿球蛋白，必須解決此方法的適用性問題，特別是需要探明影響豬血漿球蛋白得率和純度的關(guān)鍵參數(shù)。

蛋白濃度對低溫乙醇法提取蛋白具有重要影響[12]。蛋白濃度過高會引起目標(biāo)蛋白變性（形成聚合體）或者純度降低，蛋白濃度過低則會降低目標(biāo)蛋白的回收率。因此，要使球蛋白充分溶解，提高得率，第二次乙醇反應(yīng)時(shí)的沉淀物稀釋倍數(shù)非常重要。本研究的結(jié)果表明，第二次乙醇反應(yīng)時(shí)，沉淀12 倍稀釋，球蛋白得率和純度分別為25.6 %和99 %，顯著高于沉淀17 倍和22 倍稀釋時(shí)的球蛋白得率和純度（p＜0.05），說明沉淀稀釋倍數(shù)在12 倍時(shí)，比較適合豬血漿球蛋白分離。

蛋白質(zhì)是帶電的兩性電解質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于等電點(diǎn)pH 時(shí)，蛋白間的靜電荷為零，相鄰的蛋白質(zhì)由于沒有靜電斥力而集聚沉淀。豬血漿球蛋白的等電點(diǎn)pH 在5.8-7.3 之間，因此，獲得三次乙醇反應(yīng)的適宜pH 是進(jìn)行高效制備球蛋白的前提和基礎(chǔ)。第一次乙醇反應(yīng)的主要目的是沉淀血漿球蛋白，因此pH 要靠近球蛋白的等電點(diǎn)，并遠(yuǎn)離雜蛋白的等電點(diǎn)，使球蛋白形成沉淀，雜蛋白則留在上清液中。研究結(jié)果表明，pH 在7.0 時(shí)，球蛋白得率和純度分別為29.1 %和97 %，顯著高于pH為6.0 和6.5 時(shí)的蛋白得率和純度（p＜0.05），說明pH7.0 比較適合豬血漿球蛋白分離。第二次乙醇反應(yīng)的主要目的在于去除沉淀雜蛋白，pH 在5.5 時(shí)，球蛋白得率和純度分別為26.7 %和99 %，顯著高于pH 4.5 和5.0 時(shí)的得率和純度（p＜0.05），說明pH 在5.5 時(shí)適合豬血漿球蛋白分離。第三次乙醇反應(yīng)主要目的在于沉淀球蛋白。研究結(jié)果表明，pH在7.0 時(shí)，球蛋白得率和純度分別為33.0 %和98.7 %，顯著高于pH 6.0 和6.5 時(shí)的得率和純度，說明pH 在7.0 時(shí)適合豬血漿球蛋白分離。

乙醇可以降低蛋白的介電系數(shù)，使其溶解度急劇下降，隨著乙醇濃度的提高，球蛋白溶解度逐漸下降，調(diào)整乙醇濃度是沉淀球蛋白的手段之一。第二次乙醇反應(yīng)，乙醇濃度在15 %時(shí)，球蛋白得率和純度分別為30.8 %和98.4 %，顯著高于乙醇濃度在10 %和乙醇濃度在20 %時(shí)的得率和純度（p＜0.05），說明乙醇濃度在15 %時(shí)，比較適合豬血漿球蛋白分離；第三次乙醇反應(yīng)，乙醇濃度在18 %時(shí)，球蛋白得率和純度分別為28.7 %和98.5 %，顯著高于乙醇濃度在11 %和乙醇濃度在25 %時(shí)的得率和純度（p＜0.05），說明乙醇濃度在18 %時(shí)適合豬血漿球蛋白分離。

溫度是維持蛋白結(jié)構(gòu)功能的主要因素[13]，球蛋白是一種活性蛋白，制備過程中的溫度控制非常關(guān)鍵。本研究采用高精度探針式溫度計(jì)對乙醇和蛋白工作液進(jìn)行溫度檢測，在低溫恒溫槽（溫度波動范圍±0.05 ℃）內(nèi)完成三次乙醇反應(yīng)，有效保障了球蛋白制備過程的溫度要求。研究表明，全程操作溫度控制在-4 ℃至-5 ℃的情況下，豬血漿球蛋白具有較高的回收率和純度，也具有較清晰的電泳圖譜。

目前，已有低溫乙醇法提取牦牛血清球蛋白[14]和抗人T 細(xì)胞豬免疫球蛋白[15]的報(bào)道，尚無低溫乙醇法制備非特異性豬血漿球蛋白的報(bào)道，本文對低溫乙醇法制備豬血漿球蛋白進(jìn)行了適用性研究，確定了工藝步驟和關(guān)鍵參數(shù)，獲得了較高的球蛋白回收率和純度，為豬血漿球蛋白的規(guī)?；苽涮峁┝藚⒖?。