孟雅菲，申 鐵*，彭 棋，陳 震

(1.貴州師范大學(xué)貴州省信息與計(jì)算科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550000;2.貴州師范大學(xué)數(shù)學(xué)科學(xué)院，貴陽 550000)

清潔能源是一種不產(chǎn)生污染物的綠色能源，主要包括核能和可再生能源，可用在生活中的各個領(lǐng)域且對環(huán)境沒有影響.可再生能源是一類能在短時(shí)期內(nèi)，經(jīng)過自然界的不斷循環(huán)而不斷得到補(bǔ)充的能源，主要有太陽能、生物質(zhì)能、風(fēng)能等[1].隨著世界石油能源越來越匱乏和全球氣候的劇烈演變，清潔能源的開發(fā)和使用顯得尤為重要.因此，利用高科技手段獲取更多的清潔能源，已經(jīng)成為世界上越來越多的國家能源戰(zhàn)略的重要內(nèi)容.

生物質(zhì)能作為自然界中一種可再生的清潔能源，具有可獲取性強(qiáng)、污染極小、資源總量大的特點(diǎn)，使它成為無可替代的可再生能源之一.生物質(zhì)能是以生物質(zhì)為載體，通過光合生物的光合作用將光能轉(zhuǎn)化為儲存在生物體內(nèi)部的化學(xué)能，并可轉(zhuǎn)化成各種形態(tài)的燃料，用于日常生產(chǎn)生活.生物質(zhì)能是唯一可以儲存和運(yùn)輸?shù)目稍偕茉?生物質(zhì)能的有效開發(fā)、利用，對世界能源體系的建立和發(fā)展有著十分重要的意義.

光合作用是指光合生物利用可見光和光合色素所進(jìn)行的一系列生化反應(yīng)[2].這些光合生物通過光合作用將光能轉(zhuǎn)化為儲存在生物體內(nèi)的生物質(zhì)能，生物質(zhì)能的產(chǎn)生速率受光合生長速率的影響.研究影響光合速率的因素，可以找到提高生物質(zhì)能生成速率的方法，以便為實(shí)驗(yàn)研究提供可靠依據(jù).生物系統(tǒng)的各組分關(guān)系可以用網(wǎng)絡(luò)來表示，而基于蛋白質(zhì)層次的代謝網(wǎng)絡(luò)成為比較熱門的研究領(lǐng)域，通過對代謝網(wǎng)絡(luò)的研究分析，可以推測影響光合生物生長速率的重要基因.

藍(lán)藻作為最早光合放氧的原核微生物，具有遺傳背景簡單且高效固碳的特點(diǎn).藍(lán)藻中的丙酮酸鐵氧化還原蛋白酶(PFOR)是丙酮酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，丙酮酸在PFOR的催化作用下生成乙酰輔酶A和CO2，其中乙酰輔酶A是脂肪酸、氨基酸和糖類等多種有機(jī)物代謝過程的中間產(chǎn)物，在許多的代謝過程中都起著至關(guān)重要的作用.乙酰輔酶A在生物醫(yī)學(xué)的研究之中已有廣泛應(yīng)用，用于代謝疾病藥物以及抗癌藥物的研發(fā)；在三羧酸循環(huán)中也有重要作用，并且可作為合成聚酮化合物類藥物的前體分子.由于乙酰輔酶A的藥物研究價(jià)值，使得促進(jìn)其合成的酶PFOR成為重要研究對象.有研究報(bào)道稱，酶PFOR廣泛存在于古細(xì)菌、真核生物和厭氧原生動物中，由pforA基因編碼，并在丙酮酸異化中起到關(guān)鍵的作用.酶PFOR中含有的Fe-S簇蛋白，影響并參與了生物的部分分解代謝途徑和合成代謝途徑，是重要的參與酶之一.在藍(lán)藻的光自養(yǎng)性生長過程中，是一種氧敏感酶；敲除酶PFOR會更利于藍(lán)藻的生長，使得光合生長速率提高[3].因此，對酶PFOR的功能研究有待進(jìn)一步證實(shí)與探究.

實(shí)驗(yàn)研究是單點(diǎn)式，逐步研究是一個假設(shè)驅(qū)動的過程，周期較長.利用計(jì)算、仿真等方法，則可以提供初步的猜想、解釋，也在研究基因?qū)λ{(lán)藻代謝的作用中有重要價(jià)值.本實(shí)驗(yàn)采用通量平衡分析方法(FBA)、通量可變性分析方法(FVA)和多目標(biāo)優(yōu)化方法(MOO)來研究藍(lán)藻代謝網(wǎng)絡(luò)(iJB785模型)中酶與光合生長速率的關(guān)系，推測出影響光合生物生長速率的重要基因，從而對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究起指導(dǎo)性作用.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境及數(shù)據(jù)

主機(jī)配置：CPU為Intel Core i5-3230M，主頻2.60 G，內(nèi)存12.0 GB.

實(shí)驗(yàn)平臺：Matlab R2017a，Cobra Toolbox 2.0，libSBML 5.16.0，SBML Toolbox 4.1.0.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用BIGG數(shù)據(jù)庫提供的代謝模型iJB785為實(shí)驗(yàn)研究對象，包括藍(lán)藻中心代謝過程的全部信息[4].

1.2 方法介紹

1.2.1 通量平衡分析方法 通量平衡分析方法(Flux Balance Analysis，F(xiàn)BA)是一種基于約束的模擬方法，在假設(shè)代謝系統(tǒng)處于一個穩(wěn)定狀態(tài)及目標(biāo)函數(shù)達(dá)到最優(yōu)的前提下，加入化學(xué)計(jì)量系數(shù)等約束條件，將代謝網(wǎng)絡(luò)封閉在一個可行區(qū)域，使用線性規(guī)劃(LP)方法得到最優(yōu)解，并計(jì)算出該代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分布[5].FBA方法可以用于計(jì)算、預(yù)測代謝流分布，并通過這些信息反映生物代謝系統(tǒng)的生理特性和評估影響生物生長的重要因素.

FBA方法是基于靜態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)分析方法，廣泛用于生物代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物通量的研究，通過通量值可預(yù)測生物的生長速率和代謝物生成速率.FBA方法應(yīng)用于研究的時(shí)間較早，后續(xù)的通量分析方法也是以其為基礎(chǔ)而進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)探究.目前，該方法已經(jīng)在大腸桿菌、幽門螺桿菌等生物上成功應(yīng)用，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對生物代謝網(wǎng)絡(luò)的下一步研究提供更為科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1.2.2 通量可變性分析方法 通量可變性分析(Flux Variability Analysis，F(xiàn)VA)是基于靜態(tài)的、在 FBA方法基礎(chǔ)上發(fā)展而來的通量分析方法，在保證目標(biāo)反應(yīng)能夠達(dá)到最優(yōu)的前提下，求得代謝網(wǎng)絡(luò)中每個反應(yīng)的最小和最大通量值，并得到各個反應(yīng)的通量可變范圍.

必需反應(yīng)是指在代謝網(wǎng)絡(luò)達(dá)到最優(yōu)的前提下，通量可變范圍總是大于0或總是小于0的反應(yīng)，由于一個反應(yīng)通常對應(yīng)一個或多個同工酶基因，因此與這些反應(yīng)相對應(yīng)的基因并非反應(yīng)所必需的全部基因.除了必需反應(yīng)外的反應(yīng)為非必需反應(yīng)[6].通過FVA方法，可以刪除代謝系統(tǒng)中功能相同的基因，來縮小生物基因組的規(guī)模，并可以將代謝系統(tǒng)中的所有反應(yīng)分為必需反應(yīng)和非必需反應(yīng).然后利用單基因敲除方法，去除代謝系統(tǒng)中的某個基因，使該基因所催化的反應(yīng)通量值變成0.如果計(jì)算出來的目標(biāo)函數(shù)值維持原狀態(tài)不變，則該基因就是非必需基因；反之，如果發(fā)生了改變，則為必需基因[7].

1.2.3 多目標(biāo)優(yōu)化方法 多目標(biāo)優(yōu)化(Multi-objective Optimization，MOO)是同時(shí)考慮兩個或兩個以上的目標(biāo)函數(shù)，并根據(jù)目標(biāo)函數(shù)在給定的區(qū)域上獲得一組最優(yōu)解的方法，得到的解代表不同目標(biāo)函數(shù)之間的最佳權(quán)衡[8].

在自然界和細(xì)胞中，不存在單一的一個目標(biāo)函數(shù)，而是不同的細(xì)胞目標(biāo)是相互獨(dú)立且存在于不同的代謝反應(yīng)中，通常需要在多個目標(biāo)函數(shù)之中做權(quán)衡取舍，并在決策空間中獲得一個最優(yōu)化目標(biāo).多目標(biāo)優(yōu)化的解決方案是一組無限點(diǎn)集，稱為帕累托最優(yōu)集，因此可將MOO問題的結(jié)果表示為帕累托最優(yōu)集[9].由于線性目標(biāo)和凸解空間的存在，則可以利用ε約束法來獲得帕累托最優(yōu)集，把多目標(biāo)優(yōu)化轉(zhuǎn)化為在目標(biāo)最大化前提下的一個單目標(biāo)問題，而另一個目標(biāo)則合并為不等式約束ε，以此來獲得最終的最優(yōu)解集，并根據(jù)所得出的最優(yōu)解集進(jìn)行結(jié)論性的分析和總結(jié).

2 結(jié)果和討論

2.1 通量平衡分析方法

在如下的圖形處理中，由于藍(lán)藻的代謝網(wǎng)絡(luò)較為龐大，只能選取對比結(jié)果中的部分?jǐn)?shù)據(jù)作圖分析.橫坐標(biāo)代表iJB785模型代謝系統(tǒng)中849個反應(yīng)的部分反應(yīng)(90個反應(yīng))，其中，第90個反應(yīng)為目標(biāo)函數(shù)(BIOMASS_1)；縱坐標(biāo)表示敲除酶PFOR前、后各個反應(yīng)所對應(yīng)的通量值(單位：mmol·h-1).

圖1是野生型代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)FBA通量值和敲除酶PFOR后突變型代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)FBA通量值的對比圖，綜合橫向和縱向分析，在敲除酶PFOR后的突變型代謝系統(tǒng)中，有大多數(shù)反應(yīng)的通量受到了影響.由此可知，酶PFOR敲除后的代謝網(wǎng)絡(luò)，通過代謝物與輔酶耦連，對離其較遠(yuǎn)的反應(yīng)也會產(chǎn)生影響.

圖1 敲除酶PFOR后的突變型和野生型部分反應(yīng)通量值的比較Fig.1 Comparison of partial reaction flux values with mutant and wild-type after knocking out the enzyme PFOR

圖2 敲除酶PFOR后突變型和野生型部分反應(yīng)通量差值Fig.2 Difference between partial reaction flux values with mutant and wild-type after knocking out the enzyme PFOR

圖2是敲除酶PFOR后突變型代謝系統(tǒng)與野生型代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)FBA的差值，第90個反應(yīng)為目標(biāo)函數(shù)，可依據(jù)目標(biāo)函數(shù)值的前后變化來推測敲除某種酶后，對代謝系統(tǒng)是否有影響.由圖1、圖2可知，野生型目標(biāo)函數(shù)通量值為0.053 9 mmol·h-1，敲除酶PFOR后為0.053 9 mmol·h-1，且敲除酶PFOR前后，F(xiàn)BA通量差值為0 mmol·h-1，即目標(biāo)函數(shù)值保持不變.因此，該代謝系統(tǒng)敲除酶PFOR后，不會對藍(lán)藻的光合生長速率產(chǎn)生影響[10].

綜上所述，藍(lán)藻代謝系統(tǒng)中敲除酶PFOR后，有多數(shù)反應(yīng)的通量受到了影響，說明酶敲除后，通過代謝物與輔酶的耦連，對離其較遠(yuǎn)的反應(yīng)也會產(chǎn)生影響[11].酶PFOR敲除前后，目標(biāo)函數(shù)通量值保持不變，說明酶PFOR不會對藍(lán)藻的光合生長速率產(chǎn)生影響，即在藍(lán)藻的光自養(yǎng)性生長過程中，酶PFOR不起作用，是一種氧敏感酶.

2.2 通量可變性分析方法

在如下的圖形處理中，由于藍(lán)藻的代謝網(wǎng)絡(luò)較為龐大，只能選取對比結(jié)果中的部分?jǐn)?shù)據(jù)作圖分析.橫坐標(biāo)代表iJB785模型中849個反應(yīng)中的部分反應(yīng)，其中，反應(yīng)BIOMASS_1為目標(biāo)函數(shù)；縱坐標(biāo)代表各個反應(yīng)所對應(yīng)的FVA通量值(單位：mmol·h-1).

圖3 野生型代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)FVA通量值Fig.3 Partially reacted FVA flux values in the wild-type metabolic system

圖3是野生型代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)FVA通量值，即最小通量值(minflux)和最大通量值(maxflux).由圖可知，野生型代謝系統(tǒng)中酶PFOR的最小通量值為0 mmol·h-1，最大通量值為0 mmol·h-1.因此，可推測，酶PFOR的FVA通量值應(yīng)保持在很小范圍內(nèi)，數(shù)值大了不利于藍(lán)藻的生長.

圖4 敲除酶PFOR后代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)FVA通量值Fig.4 Partial reaction FVA flux value in the metabolic system after knocking out the enzyme PFOR

圖4是敲除酶PFOR后代謝系統(tǒng)中部分反應(yīng)的最小通量值(minflux)和最大通量值(maxflux)，其中BIOMASS_1是目標(biāo)函數(shù).綜合圖3和圖4可知，野生型和突變型代謝系統(tǒng)中目標(biāo)函數(shù)minflux值均為0.053 9 mmol·h-1，maxflux均為0.053 9 mmol·h-1.由此可知，敲除代謝系統(tǒng)中通量值為0 mmol·h-1的酶PFOR后，目標(biāo)函數(shù)值保持不變.因此，可推測酶PFOR是代謝系統(tǒng)中的非必需基因[12].

綜上所述，F(xiàn)VA方法能夠在已經(jīng)得到FBA方法預(yù)測的最優(yōu)解的前提下，得到代謝系統(tǒng)的通量變化范圍，即最小通量值和最大通量值.通過FVA方法的分析，可以將代謝系統(tǒng)中的所有反應(yīng)分為必需反應(yīng)和非必需反應(yīng)，運(yùn)用單基因敲除方法來篩選出非必需基因[13].依據(jù)本實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)，野生型代謝系統(tǒng)中酶PFOR的最小通量值為0 mmol·h-1，最大通量值為0 mmol·h-1；敲除通量值為0 mmol·h-1的酶PFOR后，目標(biāo)函數(shù)值保持不變(0.053 9 mmol·h-1)，那么可以推測，酶PFOR的通量值應(yīng)保持在很小范圍內(nèi)，數(shù)值大了不利于藍(lán)藻的生長；酶PFOR為該代謝系統(tǒng)的一個非必需基因.

2.3 多目標(biāo)優(yōu)化方法

在如下的圖形中，橫坐標(biāo)表示酶PFOR不同的代謝速率(通量值，單位：mmol·h-1)，縱坐標(biāo)表示目標(biāo)函數(shù)(BIOMASS_1)的生物量(單位：mmol·h-1).

圖5 酶PFOR的代謝物速率與生物量產(chǎn)量的關(guān)系Fig.5 Relationship between metabolite rate and biomass yield of the enzyme PFOR

圖5是利用ε約束法[14]得到的酶PFOR代謝速率和目標(biāo)函數(shù)(BIOMASS_1)生物質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系.據(jù)圖分析，當(dāng)酶PFOR的通量值在0～0.000 6 mmol·h-1的范圍變化時(shí)，目標(biāo)函數(shù)的通量值保持在0.053 9 mmol·h-1不變，即改變酶PFOR的通量值界限，不會對藍(lán)藻的光合生長速率產(chǎn)生影響；當(dāng)酶PFOR通量值在0.000 6～0.001 2 mmol·h-1的范圍變化時(shí)，目標(biāo)函數(shù)的通量值保持在0 mmol·h-1不變.由此可知，當(dāng)酶PFOR的通量值在一定范圍內(nèi)變化時(shí)，對藍(lán)藻的光合生長速率沒影響(正常生長)，但當(dāng)酶PFOR的通量超過某一個值后，將會對藍(lán)藻的生長起抑制作用.

綜上所述，基因敲除仿真實(shí)驗(yàn)是一種實(shí)驗(yàn)結(jié)果全和無比較強(qiáng)烈的方法，這種方法比較容易使仿真結(jié)果產(chǎn)生失真，而多目標(biāo)優(yōu)化方法能更好的描述酶PFOR和光合生長速率的關(guān)系，使得仿真結(jié)果更加符合實(shí)際[15].由結(jié)果可知，酶PFOR的通量值應(yīng)在很小范圍內(nèi)變化，這樣才更有利于藍(lán)藻的生長，數(shù)值大了會對藍(lán)藻的生長起抑制作用.

3 結(jié)論

BiGG Models是由美國基于約束的代謝流分析方面的創(chuàng)立者University of California，San Diego的帕爾遜教授研究組開發(fā)的專業(yè)代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，是相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的主要來源.該數(shù)據(jù)庫的最大特點(diǎn)是含有各類模式生物的代謝譜圖模型，用戶可以直觀的調(diào)取各種生物的整體代謝通路，也可以查看某個具體的生化反應(yīng).目前，BIGG數(shù)據(jù)庫含有2 766個代謝產(chǎn)物和3 311條代謝生化反應(yīng)，可以對代謝產(chǎn)物進(jìn)行搜索.所以，BIGG數(shù)據(jù)庫在數(shù)據(jù)量和可靠性方面都是具有科學(xué)性和可使用性的.

藍(lán)藻的代謝系統(tǒng)中敲除酶PFOR后，有多數(shù)反應(yīng)的通量受到了影響[16]，說明酶敲除后，通過代謝物與輔酶的耦連，對離其較遠(yuǎn)的反應(yīng)產(chǎn)生了影響.敲除代謝系統(tǒng)中通量值為0 mmol·h-1的酶PFOR后，目標(biāo)函數(shù)通量值保持不變，說明酶PFOR是藍(lán)藻代謝系統(tǒng)中的非必需基因.在FBA方法預(yù)測得到的最優(yōu)解的前提下，通過FVA方法得到酶PFOR的最小通量和最大通量值均為0 mmol·h-1，說明應(yīng)將代謝系統(tǒng)中酶PFOR的通量值保持在很小范圍內(nèi)，數(shù)值大了不利于藍(lán)藻的光合生長.基因敲除仿真是一種全和無的實(shí)驗(yàn)方法，通過多目標(biāo)優(yōu)化方法能更好地描述酶濃度和生物量之間的關(guān)系，在模擬實(shí)驗(yàn)中，藍(lán)藻的光合生長速率受酶PFOR濃度的影響，當(dāng)增加酶的濃度，會不利于藍(lán)藻生長；當(dāng)酶的濃度降低，光合生長率會得到提高.通過仿真計(jì)算的結(jié)果與參考文獻(xiàn)三中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較一致，說明通過仿真能更好的預(yù)測和了解代謝系統(tǒng).

本文利用藍(lán)藻的代謝網(wǎng)絡(luò)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，模擬敲除其中的酶PFOR，并利用通量平衡分析、通量可變性分析和多目標(biāo)優(yōu)化方法研究基因敲除后的突變型代謝網(wǎng)絡(luò).通過仿真實(shí)驗(yàn)研究，一方面推測出了酶PFOR對藍(lán)藻光合生長速率的影響，有利于更好地了解酶PFOR的作用；另一方面，這種仿真方法具有一定的效果，對預(yù)測和了解代謝系統(tǒng)提供了一個可行方法.對于代謝系統(tǒng)，酶PFOR可能還具有其他未知功能，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去探究.