段麗 王莉莉 顏瑩 王冠 邢焱玲 孫杰

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿﹑無早期臨床表現(xiàn)，并且缺乏有效的早期篩查和診斷方法，死亡率在婦科惡性腫瘤中高居首位。卵巢癌的治療手段主要是手術(shù)輔助化療和放療，近年，卵巢癌的治療方法正在突飛猛進(jìn)地發(fā)展，但卵巢癌的死亡率在婦科惡性腫瘤中仍居高不下。因此，發(fā)現(xiàn)有效治療卵巢癌的新型靶點(diǎn)成為迫切需要。

細(xì)胞周期的異常調(diào)控導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖是人類腫瘤發(fā)生的重要原因之一，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。其中，細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白激酶6（cyclin-dependent kinases，CDK6）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞關(guān)鍵的細(xì)胞周期重要調(diào)控因子[3]。CDK6在人類大多數(shù)腫瘤中過度激活。研究表明胃癌﹑肝癌﹑前列腺癌中均過表達(dá)，也有研究顯示CDK6 在早期卵巢癌中表達(dá)促進(jìn)了早期卵巢癌發(fā)生發(fā)展[4]。本論文擬采用RNA干擾技術(shù)，探討靶向抑制CDK6基因后對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖和粘附能力的改變，為卵巢癌靶向基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人卵巢癌HO-8910傳代細(xì)胞株購買自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。CDK6基因的shRNA表達(dá)載體由獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，CDK6及β-actin引物由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)﹑合成。熒光RT-PCR試劑盒購自美國AB公司，F(xiàn)uGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒購自德國Roche公司。其它試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。本研究經(jīng)過黑龍江省醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建5條特異性shRNA和一條陰性對(duì)照（無關(guān)序列），由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計(jì)。將處于對(duì)數(shù)生長期的卵巢癌HO-8910細(xì)胞以每孔5×l05的密度接種24孔培養(yǎng)板。按Roche轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)共分7組：Ⅰ空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）﹑Ⅱ無關(guān)序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組（shNC組）﹑陽性轉(zhuǎn)染組（ⅢshRNA-264組﹑ⅣshRNA-347組﹑ⅤshRNA-608組﹑ⅥshRNA-775組﹑ⅦshRNA-818組）。轉(zhuǎn)染后36 h﹑48 h和60 h時(shí)分別收集提取各組細(xì)胞的總RNA。應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CDK6 mRNA水平，結(jié)果顯示在各組轉(zhuǎn)染后48 h抑制率最高，其中CDK6-shRNA-608的抑制作用最強(qiáng)。因此選擇檢測(cè)CDK6-shRNA-608干擾后48 h對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖和粘附能力的影響。

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 實(shí)驗(yàn)分為3組：Ⅰ空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）﹑Ⅱ無關(guān)序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組﹑ⅢshRNA-608轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞制備成5×105mL-1濃度的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組細(xì)胞重復(fù)4孔。置于37℃﹑5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后每孔加20 μLMTT（5 mg/mL，Sigma），繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，適度振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶。調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長為490 nm進(jìn)行檢測(cè)，OD值反映細(xì)胞的增殖情況。

1.2.2 細(xì)胞-Matrigel基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn) 根據(jù)BD公司Matrigel使用說明書進(jìn)行。96孔培養(yǎng)板中每孔加入16 μL Matrigel，置37℃﹑5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育l h，PBS液洗2遍，加入200μL 0.1%BSA，37℃孵育2 h，PBS液洗2遍。轉(zhuǎn)染后48 h，用胰酶消化各組細(xì)胞后以5×105mL-1濃度接種于包被Matrigel的培養(yǎng)板，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)1 h后，用PBS液清洗未粘附的細(xì)胞2次，每孔加入100 μL含0.1%BSA的DMEM培養(yǎng)液和20 μL的MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去孔中液體，加入120 μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶。檢測(cè)490 nm OD值。

1.3 觀察指標(biāo)

轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)CDK6 mRNA的表達(dá)變化。通過檢測(cè)平均光吸收值（OD值）來反映轉(zhuǎn)染shRNA-608后48小時(shí)HO-8910細(xì)胞的增殖和粘附能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞增殖能力影響的檢測(cè)結(jié)果

利用MTT法檢測(cè)OD490值來反映轉(zhuǎn)染shRNA-608后48小時(shí)HO-8910細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，CDK6-shRNA-608轉(zhuǎn)染組的OD值明顯低于無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，表明CDK6-shRNA-608轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞數(shù)量﹑增殖活性明顯低于其他兩組，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0003，P＜0.05）。而無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.085，P＞0.05）。詳見表1。

2.2 對(duì)細(xì)胞粘附能力影響的檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用MTT法測(cè)定與Matrigel基質(zhì)粘著的三組細(xì)胞的OD值以檢測(cè)轉(zhuǎn)染shRNA-608后48小時(shí)HO-8910細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果顯示CDK6-shRNA-608轉(zhuǎn)染組的OD值明顯低于無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，表明shRNA-608可顯著抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖，CDK6-shRNA-608轉(zhuǎn)染卵巢癌HO-8910細(xì)胞后，其與基質(zhì)的粘附能力顯著降低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0004，P＜0.05）。而無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.137，P＞0.05）。詳見表1。

3 討論

卵巢癌以發(fā)病隱匿﹑無早期臨床表現(xiàn)﹑缺乏有效的早期篩查和診斷方法而成為女性重要的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。多數(shù)患者在晚期時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，死亡率高，經(jīng)過腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及術(shù)后輔以化療后，部分患者出現(xiàn)病情緩解，但一部分患者表現(xiàn)出化療耐藥和病情進(jìn)展或者復(fù)發(fā)。闡明卵巢癌的發(fā)生﹑發(fā)展機(jī)制，采用針對(duì)性的藥物治療﹑尋求有效的藥物治療靶點(diǎn)，成為科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤均存在CDK6基因擴(kuò)增﹑過表達(dá)或CDK6活性增強(qiáng)，包括鼻咽癌﹑膀胱癌﹑胰腺癌﹑食道癌和粘液纖維肉瘤等腫瘤[5-7]。進(jìn)入21世紀(jì)以來，利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）進(jìn)行人類疾病的治療已受到極大關(guān)注，包括病毒感染性疾病和腫瘤治療[8-9]。siRNA可以通過RNAi效應(yīng)特異性地沉默靶向基因，shRNA是具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA前體，將人工設(shè)計(jì)合成的shRNA的模板DNA分子通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出shRNA可用于癌癥的治療[10-12]。本研究也同樣使用shRNA技術(shù)研究干擾CDK6基因?qū)β殉舶┘?xì)胞HO-8910增殖和粘附能力的影響，初步證實(shí)shRNA可靶向沉默CDK6基因，進(jìn)而顯著降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和粘附能力。

表1 CDK6 shRNA 對(duì)人卵巢癌HO8910 細(xì)胞增殖和粘附影響檢測(cè)結(jié)果

綜上所述，沉默CDK6基因可抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖和粘附能力。CDK6與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有望作為腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。