趙婉清　張敏　劉佳　高志忠　伊文博　柳大軍

摘 要：利用CodonW、MEGA、EasyCodeML、CAIcal等軟件及在線程序分析密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)（GC含量、ENC值、CAI值和CBI值），以明確圓臀大黽蝽線粒體蛋白編碼基因的密碼子使用偏好性和COI基因的適應(yīng)性進(jìn)化。通過(guò)中性繪圖和ENC-plot分析了密碼子偏好性的形成原因，采用位點(diǎn)模型研究COI基因的選擇壓力。結(jié)果表明，多數(shù)最優(yōu)密碼子以U結(jié)尾，RSCU值較高的密碼子大部分都以A/U結(jié)尾;中性繪圖和ENC-plot分析表明密碼子偏好性主要受選擇壓力的影響;選擇壓力分析表明COI基因受到較強(qiáng)的純化選擇的作用，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)正選擇位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：圓臀大黽蝽;線粒體;密碼子偏好性;COI;選擇壓力

中圖分類號(hào) S432.44;Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）08-0010-05

Abstract： This study aims to clarify the codon usage bias in mitochondrial protein-coding genes of Aquarius paludum and the adaptive evolution of COI gene. CodonW， MEGA， EasyCodeML and CAIcal were used to analyze the relative parameters of codon usage bias （GC content， ENC， CAI and CBI）. Neutrality plots and ENC-plot were used to analyze the reason of codon usage bias. Site model was used to analyze the selection pressures of COI gene. The results showed that most optimal codons end with U， and most codons with higher RSCU values end with A/U. Selection pressure was major influence factor on codon usage in mitochondrial genome of Aquarius paludum. The selective pressure analysis indicated that the COI gene was subjected to strong purification selection and no positive selection sites were found.

Key words： Aquarius paludum; Mitogenome; Codon usage bias; COI; Selection pressure

密碼子識(shí)別是DNA序列成為功能性片段的必要過(guò)程。依據(jù)中心法則，遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄從DNA傳遞到mRNA上，然后再經(jīng)過(guò)翻譯過(guò)程傳遞給蛋白質(zhì)[1]。mRNA中每個(gè)三聯(lián)體密碼子都與tRNA上的1個(gè)三聯(lián)體反密碼子相對(duì)應(yīng)，除終止密碼子不編碼任何氨基酸，其余61個(gè)密碼子編碼構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸時(shí)就出現(xiàn)了冗余現(xiàn)象，即密碼子的簡(jiǎn)并性[2]。研究表明，同義密碼子的使用并不是完全隨機(jī)，物種在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中會(huì)有適應(yīng)性改變，從而偏好使用某些密碼子，最優(yōu)先被使用的密碼子常出現(xiàn)在高表達(dá)基因中[3-4]。物種對(duì)密碼子的偏好性提高了蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的時(shí)效性和準(zhǔn)確性，對(duì)同義密碼子使用偏好性的分析有助于深入了解物種的基因功能。

生物體在進(jìn)化的過(guò)程中，基因的改變有2種情況：一種是密碼子發(fā)生改變，但是其編碼的氨基酸不發(fā)生改變;另一種是密碼子改變引起了編碼氨基酸的改變。前者稱之為同義替換（dS），后者稱之為非同義替換（dN）[5]。蛋白編碼基因?yàn)楸３纸Y(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，非同義替換數(shù)目小于同義替換數(shù)目（dN/dS<1），受到凈化選擇（負(fù)選擇）的作用。但是在保守的蛋白編碼基因中也存在受到正選擇壓力的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在物種進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境中起著重要的作用[6]。隨著線粒體基因組序列的廣泛報(bào)道，關(guān)于線粒體基因適應(yīng)性進(jìn)化的研究也越來(lái)越多，某些蛋白編碼基因的正選擇壓力影響物種對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)能力和機(jī)體功能的提高[7-8]。

線粒體COI基因是構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、快速鑒定、檢測(cè)分化速率的常用線粒體基因[9]。COI基因作為核心酶，在電子傳遞鏈中具有重要的功能。其次，該基因雖然比較保守，但是它的進(jìn)化速率仍然要比核基因快很多[10]。大量研究表明，昆蟲的COI基因受到較強(qiáng)的凈化選擇壓力，但是在適應(yīng)不同環(huán)境的前提下，物種面臨的生存壓力不同，COI基因作出的適應(yīng)性進(jìn)化選擇也不相同[11]。本研究通過(guò)對(duì)圓臀大黽蝽線粒體基因組蛋白編碼基因的密碼子使用情況進(jìn)行分析，了解該物種使用偏好性較高的密碼子，確定最優(yōu)密碼，探究影響其密碼子使用模式的因素，并比較異翅亞目昆蟲COI基因的適應(yīng)性進(jìn)化，以期為昆蟲線粒體基因的適應(yīng)性進(jìn)化提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 序列獲取 本研究所采用的序列均來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https//www ncbi.Nlm.nih.gov/），圓臀大黽蝽（Aquarius paludum）線粒體蛋白編碼基因序列用于密碼子偏好性分析，另下載20條異翅亞目COI基因序列用于適應(yīng)性進(jìn)化分析，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 密碼子偏好性的分析方法 Codon W軟件和CAIcal在線程序用于統(tǒng)計(jì)有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codons，ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon Adaptation Index，CAI）、密碼子偏好指數(shù)（Codon Bias Index，CBI）以及序列總GC含量（GC）、密碼子各位點(diǎn)GC含量（GC1，GC2，GC3）、密碼子第3位同義密碼子GC含量（GC3s）。序列的相對(duì)同義密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU）運(yùn)用MEGA 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。最優(yōu)密碼子的篩選采用高表達(dá)優(yōu)越密碼子方法，按照ENC值大小分別選取有序數(shù)據(jù)集前后10%組成高、低表達(dá)數(shù)據(jù)集，根據(jù)2個(gè)數(shù)據(jù)集的△RSCU值來(lái)確定最優(yōu)密碼子。

對(duì)密碼子偏好性影響因素的分析采用中性繪圖分析和ENC-plot分析進(jìn)行研究，分別以GC3和GC3s為橫坐標(biāo)，GC12和ENC為縱坐標(biāo)作圖。通過(guò)分析橫縱坐標(biāo)2因素的相關(guān)性，分析該物種密碼子偏好性的成因。ENC-plot分析中所采用的的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為ENC=2+GC3S+29/[GC3S2+（1-GC3S）2]。

1.3 選擇壓力分析 用ω來(lái)表示基因受到何種選擇作用的壓力（ω=dN/dS），本研究基于EasyCodeML軟件分析COI基因的選擇壓力。位點(diǎn)模型（Site Model）假設(shè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的不同分支所受選擇壓力相同，但不同的氨基酸位點(diǎn)經(jīng)歷的選擇壓力不同。分別選取3組位點(diǎn)特異模型進(jìn)行比較：M0（單一比率）與M3（離散），M1a（近中性）與M2a（正選擇），M7（beta）與M8（beta & ω）。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成及相關(guān)參數(shù) 圓臀大黽蝽線粒體基因組共有13個(gè)蛋白編碼基因，對(duì)這些序列的堿基組成進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，序列的GC含量均低于50%，含量最高為COIII（31.30%），最低為ATP8（11.54%），說(shuō)明圓臀大黽蝽線粒體基因組序列的AT含量遠(yuǎn)高于GC的含量。密碼子3個(gè)位點(diǎn)的GC含量存在差異，除COII、CytB、ND1和ND4的密碼子第1位點(diǎn)的GC含量高于第2位點(diǎn)的GC含量，其余基因密碼子3個(gè)位點(diǎn)GC含量由大到小排列均為GC2>GC1>GC3，說(shuō)明密碼子第3位堿基更偏好使用A或U結(jié)尾。

ENC值、CAI值和CBI值的計(jì)算結(jié)果如表2所示。由表2可知，當(dāng)ENC值越接近于20，密碼子的偏好性越強(qiáng)，ENC值越接近于61，則偏好性越弱。本研究中ENC值的范圍為21.96～36.77，平均值31.99，說(shuō)明圓臀大黽蝽線粒體基因密碼子使用具有一定的偏好性。CAI值取值范圍為0.06～0.15（平均值0.10），CBI值的范圍為-0.36～-0.17（平均值-0.27），這2項(xiàng)指標(biāo)從基因表達(dá)水平和高表達(dá)密碼子方面同樣說(shuō)明了圓臀大黽蝽線粒體基因密碼子使用的偏好性。

2.2 同義密碼子相對(duì)使用度及最優(yōu)密碼子 同義密碼子相對(duì)使用度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，圓臀大黽蝽線粒體蛋白編碼基因的密碼子，共有30個(gè)密碼子的RSCU值大于1（下劃線標(biāo)示）。其中，密碼子第3位以A或U結(jié)尾的有28個(gè)，如UUA（RSCU=2.83）、UCA（RSCU=2.15）、UAU（RSCU=1.59）等，以C結(jié)尾的有1個(gè)，以G結(jié)尾的有1個(gè)。在RSCU值小于1的密碼子中，91%的密碼子以G或C結(jié)尾。由于RSCU值表示密碼子實(shí)際使用的頻率與不考慮偏好性時(shí)理論情況下的使用頻率間的比值，RSCU值大于1的密碼子則為編碼該氨基酸時(shí)偏好使用的密碼子，RSCU值小于1則表示該密碼子編碼氨基酸時(shí)具有較弱的使用偏好性。

根據(jù)各基因的ENC值排序，篩選出由COIII、ND1組成的高表達(dá)組和ND6、ATP8組成的低表達(dá)組。由表4可知，通過(guò)計(jì)算2個(gè)基因組的RSCU值，找出△RSCU大于0.08且在高表達(dá)組中RSCU值大于1的密碼子，最終確定了UUG、AUU、GUU、UCU、CCU、ACU、GCU、UAU、CAU、AAU、GAU、UGU、CGU和GGU共14個(gè)最優(yōu)密碼子（*表示）。其中有13個(gè)最優(yōu)密碼子以U結(jié)尾，1個(gè)以G結(jié)尾，表明U結(jié)尾的密碼子是圓臀大黽蝽線粒體蛋白編碼基因優(yōu)先偏好使用的密碼子。

2.3 中性繪圖和ENC-plot分析 中性繪圖是通過(guò)判斷物種GC12含量與GC3的相關(guān)性，確定該物種線粒體基因受到選擇壓力還是突變壓力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，GC12含量的變化范圍在14.42%～39.26%（平均值27.84%），GC3含量的變化范圍在5.77%～26.54%（平均值13.53%）。各基因所代表的點(diǎn)均未落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，回歸曲線雖傾斜但斜率很小，說(shuō)明GC12與GC3低度相關(guān)，只有極其微弱的突變作用影響密碼子的偏好使用。

ENC-plot結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，GC3s含量的變化范圍在6.40%～22.67%之間（平均值12.93%），ENC值的變化范圍在21.96～36.77之間（平均值31.99）。圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線表示密碼子的使用只受到突變壓力的作用，而各基因所代表的點(diǎn)均分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線的左下方，說(shuō)明突變作用在圓臀大黽蝽線粒體蛋白編碼基因密碼子使用偏好性中影響弱，選擇作用為主要的影響因素。

2.4 選擇壓力 除圓臀大黽蝽的COI基因序列外，本研究另選取異翅亞目20條COI基因序列，經(jīng)比對(duì)后得到長(zhǎng)度為1542bp的矩陣。其中保守位點(diǎn)595個(gè)，變異位點(diǎn)947個(gè)，單突變位點(diǎn)69個(gè)，簡(jiǎn)約性位點(diǎn)877個(gè)。分析6個(gè)不同模型得到相關(guān)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，在位點(diǎn)模型中，M3、M2a和M8模型的ω可以為大于1的數(shù)值。M0模型預(yù)測(cè)的ω值0.034，遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明所選取COI基因序列整體上受到凈化選擇的作用。LRT檢驗(yàn)結(jié)果顯示，M0與M3的模型比較下，p值小于0.01，說(shuō)明M3模型比M0模型更適合;M1a與M2a模型比較下，p值大于0.99接近于1，說(shuō)明這2種模型都沒(méi)有優(yōu)于對(duì)方;M7與M8模型比較的結(jié)果與M1a與M2a類似。M1a模型的ω值等于1，但是在6個(gè)模型中均未檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

作為聯(lián)系基因和蛋白質(zhì)的紐帶，密碼子在遺傳信息發(fā)揮生物功能中具有重要的生物學(xué)意義。圓臀大黽蝽線粒體基因組包含13個(gè)蛋白編碼基因，其在進(jìn)化過(guò)程中形成了一套適應(yīng)自身基因組的密碼子使用特征[12]。本研究中，圓臀大黽蝽線粒體蛋白編碼基因的平均GC含量為23.07%，ENC值為31.99，CAI值為0.10，均說(shuō)明該物種偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子，且偏好性相對(duì)較弱。RSCU分析和最優(yōu)密碼子統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)一步顯示，圓臀大黽蝽更偏好使用以U結(jié)尾的密碼子，最優(yōu)密碼子中使用頻率最高的是編碼絲氨酸的密碼子UCU。

由于密碼子的簡(jiǎn)并性，第3位堿基的改變一般不改變其編碼的氨基酸，所以分析密碼子第3位的堿基組成對(duì)研究密碼子使用偏好性的成因有重要作用。圓臀大黽蝽線粒體蛋白編碼基因的GC3遠(yuǎn)小于GC1和GC2，說(shuō)明第3位偏好使用A/U堿基，這與蛋白編碼基因整體的GC含量和RSCU結(jié)果一致。同時(shí)，與密碼子第3位相關(guān)的中性繪圖分析和ENC-plot分析結(jié)果顯示，影響圓臀大黽蝽線粒體基因密碼子使用偏好性的主要因素為選擇壓力，受突變因素的影響較弱，這一結(jié)果與多數(shù)昆蟲線粒體基因組密碼子偏好性分析相一致[13]。

COI基因是線粒體基因中最常使用的分子標(biāo)記，也是研究物種進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育時(shí)優(yōu)先選擇的基因。本研究選擇異翅亞目21條COI基因序列，比較不同物種中該基因的選擇壓力。通過(guò)進(jìn)行位點(diǎn)模型分析，證明異翅亞目昆蟲線粒體COI基因主要受到了純化選擇的作用，沒(méi)有檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)。COI基因的進(jìn)化速率雖然比核基因快2～9倍，但是在進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性。本研究為研究昆蟲對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化提供了理論依據(jù)，但是要深入了解線粒體蛋白編碼基因的適應(yīng)性進(jìn)化還需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)編：張 麗）