王云龍， 劉 松， 馮 岳， 堵國(guó)成， 陳 堅(jiān)*

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase，EC 3.5.1.1，LASNase)是一種酰胺基水解酶，可以將天冬酰胺脫氨基生成天冬氨酸和氨[1]。 該酶具有抗腫瘤活性，已被用于治療淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤及霍金森病等疾病[2]。 最新報(bào)道中顯示該酶也可用于油炸食品中以減少丙烯酰胺的生成[3-4]。 由于L-ASNase 在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域中的重要應(yīng)用，已引起國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者的極大興趣。

L-ASNase 廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中[5]。 但是由于動(dòng)植物中L-ASNase 含量少， 分離提取操作困難，而微生物發(fā)酵法具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、提取純化簡(jiǎn)便以及易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)， 已成為商品化LASNase 的主要來源[6]。 由于野生菌發(fā)酵L-ASNase產(chǎn)量往往較低[7-8]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始構(gòu)建L-ASNase酶重組菌并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。 Khushoo 等人通過指數(shù)流加策略控制重組菌E.coliBLR（DE3）比生長(zhǎng)速率并優(yōu)化誘導(dǎo)劑添加時(shí)間， 使L-ASNase 酶活達(dá)到870 U/mL[9]。 龍水清通過雙階段控制溶氧策略促進(jìn)B. subtilis168/pMA5-ansz產(chǎn)酶，總酶活達(dá)到112.61 U/mL[10]。 Chityala 等人 在B.subtilisWB800N中表達(dá)P.carotovorumMTCC 1428 來源的L-ASNase基因， 通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及持續(xù)誘導(dǎo)策略使LASNase 的產(chǎn)量達(dá)到525.98 U/mL[11]。

本研究以研究室前期構(gòu)建的菌株Bacillus subtilis/ASNΔ25/B2 為生產(chǎn)菌株[12]，擬在優(yōu)化攪拌轉(zhuǎn)速的基礎(chǔ)上對(duì)其補(bǔ)料分批發(fā)酵條件進(jìn)行研究，考察了補(bǔ)料時(shí)間、補(bǔ)料培養(yǎng)基組成、補(bǔ)料量以及流加方式對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響， 建立了3 L 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，為L(zhǎng)-ASNase 工業(yè)化生產(chǎn)提供重要參考。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：Bacillus subtilis/ASNΔ25/B2[12]，由江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室構(gòu)建并保藏。

XWY-240 恒溫?fù)u床： 上海智誠(chéng)儀器有限公司產(chǎn)品；3 L 發(fā)酵罐：迪必爾生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品；Agilent 1260 System 高效液相色譜儀： 美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)品；UV-2450 型紫外-可見分光光度計(jì)：日本Shimadzu 公司產(chǎn)品；pH 計(jì)：瑞士Mettler 公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 卡那平板培養(yǎng)基（g/L） 胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂20，硫酸卡那霉素0.05。

1.2.2 種子培養(yǎng)基（g/L） 胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，硫酸卡那霉素0.05。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 酵母蛋白胨28.0，硫酸銨4.0， 玉 米 漿11.0，K2HPO4·3H2O 22.5，KH2PO411.5，MgSO4·7H2O 1.0，NaCl 3.3，L-天冬酰胺2，蔗糖65.0，硫酸卡那霉素0.05；初始pH 7.5。

1.2.4 補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L） 碳源：蔗糖800；混合氮源：酵母蛋白胨200，玉米漿80。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子活化 取適量保存在冷凍甘油管中的菌液涂布至卡那平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.3.2 種子培養(yǎng) 將活化好的種子接種至裝有60 mL種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，添加60 μL的50 mg/mL 硫酸卡那霉素，搖床溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)8～10 h。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量將種子培養(yǎng)基接入裝有25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min。

1.3.4 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量將種子培養(yǎng)基接入裝有1.5 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L 發(fā)酵罐中，通氣量2 vvm，溫度37 ℃，初始pH 7.5。 本研究中所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取其平均值。

1.3.5 補(bǔ)料分批發(fā)酵 0～8 h 攪拌轉(zhuǎn)速為700 r/min，8 h 以后攪拌轉(zhuǎn)速為900 r/min。16 ～28 h 以32 mL/h平均流速進(jìn)行恒速流加酵母蛋白胨和玉米漿混合氮源。

間歇性流加：16 h 開始每隔2 h 補(bǔ)加37.5 mL 蔗糖。

恒速流加：16～28 h 以平均流速18.75 mL/h 恒速流加蔗糖。

指數(shù)流加：蔗糖流加速率按如下公式計(jì)算：

式中F（t）為蔗糖流加速率（L/h），μset為設(shè)定的比生長(zhǎng)速率（0.2 h-1），X0代表初始菌體干質(zhì)量濃度（g/L），V0為初始發(fā)酵液體積（L），t為指數(shù)流加的時(shí)間（h），Sf為補(bǔ)加的蔗糖質(zhì)量濃度（800 g/L），S0為指數(shù)流加開始時(shí)的殘留蔗糖質(zhì)量濃度（g/L），YX/S為菌體對(duì)底物的得率系數(shù)（0.29 g/g）。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體濃度的測(cè)定 采用濁度法測(cè)定。 取適量發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后使用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm 下測(cè)定吸光度，即OD600。

1.4.2 L-ASNase 粗酶液制備 取一定量的發(fā)酵液12000 r/min 離心10 min，上清液即為L(zhǎng)-ASNase 粗酶液。

1.4.3 L-ASNase 酶活測(cè)定 采用奈氏試劑法[13]。取900 μL 磷酸鹽緩沖液 （20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液，pH 7.5）加入200 μL 底物（L-天冬酰胺，0.15 mol/L）于37 ℃保溫10～20 min 后， 加入100 μL 稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的L-ASNase 粗酶液，37 ℃反應(yīng)10 min 后加入100 μL 終止劑（三氯乙酸，1.5 mol/L）終止反應(yīng)，對(duì)照組在保溫前即加入終止劑。 反應(yīng)結(jié)束后12000 r/min 離心2 min，取100 μL 上清液，加入3400 μL 去離子水和500 μL 奈氏試劑， 混勻后在波長(zhǎng)436 nm 下測(cè)定吸光度。

酶活力單位定義：37 ℃每分鐘水解L-天冬酰胺生成1 μmol 氨所需要的酶量定義為一個(gè)LASNase 活力單位。

1.4.4 蔗糖質(zhì)量濃度測(cè)定 采用高效液相色譜法[12]。液相儀：Agilent 1260；檢測(cè)器：RID；色譜柱：Aminex HPX-87H，300 mm×7.8 mm 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相：5 mmol/L 硫酸； 流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL。

1.4.5 比速率的計(jì)算 使用Origin 軟件處理[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)L-ASNase 分批發(fā)酵過程的影響

在發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速一方面會(huì)影響到環(huán)境中溶氧（DO）的變化，另一方面過大的轉(zhuǎn)速產(chǎn)生剪切力也會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]，發(fā)酵液中的溶氧水平對(duì)L-ASNase 的合成影響較大[16-17]。 故在3 L 發(fā)酵罐水平進(jìn)行分批發(fā)酵， 考察攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)B.subtilis/ASNΔ25/B2 菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，共選取了600、700、800、900 r/min 4 個(gè)轉(zhuǎn)速進(jìn)行研究。 不同攪拌轉(zhuǎn)速發(fā)酵過程中溶氧的變化情況如圖1（a）所示，在整個(gè)發(fā)酵過程中溶氧呈先下降后上升的趨勢(shì)。 在0～20 h，由于菌體生長(zhǎng)代謝作用需要消耗大量溶解氧，溶氧水平一直呈下降趨勢(shì)， 而后期需氧量明顯下降。 不同的攪拌轉(zhuǎn)速所能提供的溶氧水平差異較大，600 r/min 在8 h 時(shí)DO 只有10.9%，8～24 h DO一直處于很低的水平， 接近于0；700 r/min 在12 h之后溶氧迅速下降到0.9%；800 r/min 能維持DO 在20%以上；900 r/min 能維持DO 在30%以上。

不同攪拌轉(zhuǎn)速下OD600隨時(shí)間變化情況如圖1（b）所示。 與攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min 相比，700、800、900 r/min 條件下OD600分別提高了4.9%、14.5%、14.9%。 這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌是好氧微生物[10]，而600 r/min 和700 r/min 溶氧均在16～24 h 處于較低水平，影響了菌體生長(zhǎng)。

不同攪拌轉(zhuǎn)速下菌體比生長(zhǎng)速率變化情況如圖1（c）所示，比生長(zhǎng)速率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，600、700、800、900 r/min 比生長(zhǎng)速率分別在6.5、5、5、5.5 h 達(dá)到最大。在8 h 前由于溶氧充足，而700 r/min剪切力小，故其比生長(zhǎng)速率高于其他轉(zhuǎn)速。在8 h 以后，菌體已經(jīng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)溶氧要求較高，而高轉(zhuǎn)速能提供更高的溶解氧， 更適合菌體生長(zhǎng)，故900 r/min 比生長(zhǎng)速率高于700 r/min。

結(jié)合圖1（b）和圖1（d）可知B.subtilis/ASNΔ25/B2 產(chǎn)L-ASNase 屬于延續(xù)合成型。在0 ～ 24 h，隨著菌體的生長(zhǎng)L-ASNase 酶活也逐漸增加， 當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)酶依然繼續(xù)，且酶活和生物量呈正相關(guān)。 與攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min 相比，700、800 r/min 和900 r/min 條件下酶活分別提高9.4%、25.4%和25.9%。發(fā)酵前期， 不同攪拌轉(zhuǎn)速下L-ASNase 的比產(chǎn)酶速率接近，8 h 之后900 r/min 的比產(chǎn)酶速率要明顯高于其他轉(zhuǎn)速。 這說明較高的溶氧不僅對(duì)菌體生長(zhǎng)有利，也可促進(jìn)菌體產(chǎn)酶。

根據(jù)上述結(jié)果， 為了進(jìn)一步提高L-ASNase 產(chǎn)量， 提出兩階段控制攪拌轉(zhuǎn)速策略即0～8 h 將攪拌轉(zhuǎn)速控制在700 r/min，8 h 之后將攪拌轉(zhuǎn)速控制在900 r/min。 發(fā)酵過程曲線如圖1（f）所示，溶氧水平能維持在30%以上， 可以滿足菌體對(duì)溶氧的要求，發(fā)酵周期由40 h 提前到36 h，最大酶活也進(jìn)一步提高，達(dá)到850.6 U/mL。 不同攪拌轉(zhuǎn)速下發(fā)酵過程參數(shù)見表1，與恒定轉(zhuǎn)速600 r/min 相比，兩階段控制轉(zhuǎn)速條件下菌體OD600、酶活和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了18.8%、31.9%、46.6%。

2.2 補(bǔ)料時(shí)間對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響

兩階段控制攪拌轉(zhuǎn)速分批發(fā)酵過程中蔗糖消耗情況如圖2（a）所示，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，蔗糖不斷消耗，在20 h 即將耗盡。如果增加蔗糖供應(yīng)，可能會(huì)進(jìn)一步提高菌體量和酶產(chǎn)量。 在分批發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中殘留蔗糖質(zhì)量濃度一直在減小，菌體對(duì)蔗糖的消耗速度也在不斷發(fā)生變化，在不同時(shí)間開始補(bǔ)加蔗糖， 對(duì)菌體生長(zhǎng)可能會(huì)產(chǎn)生不同的影響。 因此，為了確定蔗糖的最佳補(bǔ)料時(shí)機(jī)，分別研究了在發(fā)酵過程進(jìn)行到16、18、20 h 開始每隔2 小時(shí)間歇性流加蔗糖，補(bǔ)糖總量為80 g/L，分4 次補(bǔ)加到發(fā)酵罐中，結(jié)果如圖2 所示。

圖1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)L-ASNase 分批發(fā)酵過程的影響Fig. 1 Influence of stirring speed on the production of L-asparaginase in batch fermentation

表1 不同攪拌轉(zhuǎn)速下L-ASNase 分批發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation parameters among batches with different stirring speed conditions

圖2 補(bǔ)料時(shí)間對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響Fig. 2 Influence of feeding time on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

當(dāng)發(fā)酵過程進(jìn)行到16 h 時(shí)發(fā)酵液中的蔗糖質(zhì)量濃度減少到10 g/L 左右， 此時(shí)溶氧還沒反彈，菌體正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)蔗糖的消耗速度較快。 由圖2（b）可知，在此時(shí)補(bǔ)加蔗糖能很好的滿足菌體對(duì)蔗糖的需求， 菌體OD600進(jìn)一步提高， 在28 h 達(dá)到60.3，和分批發(fā)酵相比提高了12.1%，酶活在44 h 達(dá)到972.1 U/mL，和分批發(fā)酵相比提高了14.3%。當(dāng)發(fā)酵過程進(jìn)行到18 h 時(shí)發(fā)酵液中的蔗糖質(zhì)量濃度減少到4 g/L 左右，菌體對(duì)蔗糖的消耗速度和16 h 相比減小很多。 在此時(shí)開始補(bǔ)加蔗糖（圖2（c）），和分批發(fā)酵相比，OD600和酶活分別提高了5.1%、11.8%。當(dāng)發(fā)酵過程進(jìn)行到20 h 時(shí)發(fā)酵液中的蔗糖質(zhì)量濃度僅剩1 g/L 左右，菌體開始進(jìn)入穩(wěn)定期，在此時(shí)開始補(bǔ)加蔗糖（圖2（d）），由于補(bǔ)料太遲，菌體所需的能量不能及時(shí)供給，OD600無明顯提高， 酶活僅提高了9.9%。 故選擇在16 h 開始補(bǔ)加蔗糖。

2.3 補(bǔ)料培養(yǎng)基組成對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響

由補(bǔ)料時(shí)間結(jié)果可知， 在16 h 單一補(bǔ)加蔗糖，菌體量雖然有所提高，但提高幅度不大。 菌體生長(zhǎng)還需要其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，僅僅補(bǔ)加碳源對(duì)提高菌體量和酶產(chǎn)量作用有限[14]。 故進(jìn)一步研究了補(bǔ)料培養(yǎng)基組成對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響。

首先在搖瓶水平上通過蔗糖、酵母蛋白胨和玉米漿的不同組合研究補(bǔ)料培養(yǎng)基組成對(duì)B.subtilis/ASNΔ25/B2 產(chǎn)L-ASNase 的影響， 以此作為在發(fā)酵罐上進(jìn)一步放大的基礎(chǔ)，結(jié)果如圖3（a）所示。 和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的OD600和酶活均有提高，說明補(bǔ)加培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶有利。 比較實(shí)驗(yàn)組可知，補(bǔ)加蔗糖的同時(shí)再補(bǔ)加酵母蛋白胨或玉米漿效果都比單一補(bǔ)加蔗糖更好，三者一起補(bǔ)加時(shí)效果最好，這可能是因?yàn)榻湍傅鞍纂撕陀衩诐{中除了含有菌體生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還含有產(chǎn)酶的前體物質(zhì)[18]。 和對(duì)照組相比，三者一起補(bǔ)加使OD600提高了45.5%，酶活提高了43.8%。 故在3 L 發(fā)酵罐上選擇同時(shí)補(bǔ)加蔗糖、酵母蛋白胨和玉米漿進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵過程曲線如圖3（b）所示。OD600在32 h 達(dá)到91.1，酶活在48 h 達(dá)到1136.9 U/mL，和16 h 單一補(bǔ)加蔗糖相比，分別提高了51.1%、17%。

2.4 補(bǔ)料量對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響

由上述結(jié)果可知，同時(shí)補(bǔ)加蔗糖、酵母蛋白胨和玉米漿，OD600和酶活都有較大的提高， 如果延長(zhǎng)補(bǔ)料時(shí)間， 繼續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，OD600和酶活可能會(huì)進(jìn)一步提高，故有必要對(duì)培養(yǎng)基補(bǔ)加量進(jìn)行研究。

圖3 補(bǔ)料培養(yǎng)基組成對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程影響Fig. 3 Influence of composition of feed medium on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

在發(fā)酵過程進(jìn)行到16 h 時(shí)開始每隔2 小時(shí)補(bǔ)加一次蔗糖，分別補(bǔ)加4、6、8 次，蔗糖補(bǔ)加總量分別為80、120、160 g/L。在補(bǔ)加蔗糖的同時(shí)，按發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖、 酵母蛋白胨和玉米漿的比例，以32 mL/h 恒速補(bǔ)加酵母蛋白胨和玉米漿混合氮源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。 當(dāng)蔗糖補(bǔ)加量為80 g/L 時(shí)，在消耗蔗糖的同時(shí)OD600逐漸增加， 發(fā)酵32 h 時(shí)蔗糖耗盡，OD600在32 h 達(dá)到最大值91.1，L-ASNase 酶活在48 h 達(dá)到最大為1136.9 U/mL。 當(dāng)蔗糖補(bǔ)加量為120 g/L 時(shí)，發(fā)酵40 h 蔗糖耗盡，在細(xì)胞耗糖的同時(shí)OD600逐漸平穩(wěn)增加， 在40 h 達(dá)到最大值119.7，酶活也隨著菌體生長(zhǎng)不斷增加，在48 h 達(dá)到最大值1279.6 U/mL。當(dāng)蔗糖補(bǔ)加量增加到160 g/L 時(shí)，蔗糖在44 h 才消耗完全，OD600在40 h 達(dá)到最大為121.6， 和補(bǔ)糖總量120 g/L 時(shí)所能達(dá)到的OD600接近，L-ASNase 酶活在48 h 達(dá)到最大值1294.6 U/mL。雖然酶活最大值比補(bǔ)糖總量120 g/L 時(shí)有少量增加，但不是很顯著，且消耗了更多的原料。 故為了節(jié)約成本，選擇蔗糖補(bǔ)加量為120 g/L。

圖4 補(bǔ)料量對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響Fig. 4 Influence of feeding quantity on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

2.5 流加方式對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響

碳源的流加方式對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程有著重要影響。 非反饋式流加主要包括脈沖式流加、恒速流加、指數(shù)流加和間歇性流加等[19]，不同的產(chǎn)物、不同的菌體適合不同的補(bǔ)料策略。 為了進(jìn)一步研究蔗糖流加方式對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響，在間歇性流加的結(jié)果之上采用恒速流加和指數(shù)流加進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程曲線如圖5 所示。

由圖5（b）可知，當(dāng)在16～28 h 以18.75 mL/h 平均流速恒速流加蔗糖時(shí)，細(xì)胞OD600一直平穩(wěn)增加，在44 h 達(dá)到最大值128.6，L-ASNase 酶活在48 h達(dá)到最大值1413.6 U/mL，和間歇性流加（圖5（a））相比，酶活進(jìn)一步提高。 由圖5（c）可知，當(dāng)發(fā)酵16 h時(shí)開始指數(shù)流加蔗糖時(shí)， 菌體OD600在32 h 達(dá)到最大值81.2，L-ASNase 酶活在44 h 達(dá)到最大值1048.9 U/mL，和間歇性流加相比酶活下降。 這可能是因?yàn)檎崽遣⒎前l(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一碳源，且流加速率是通過理論計(jì)算得到的[20]，導(dǎo)致蔗糖沒能及時(shí)消耗，使菌體濃度減小，干擾了菌體的生長(zhǎng)代謝，故最終沒有達(dá)到較好的效果。 不同流加方式發(fā)酵過程參數(shù)如表2 所示， 和間歇性流加相比， 恒速流加OD600、酶活、生產(chǎn)強(qiáng)度都進(jìn)一步提高。 指數(shù)流加雖然發(fā)酵周期較短，但是蔗糖轉(zhuǎn)化率、OD600和酶活較低，導(dǎo)致其生產(chǎn)強(qiáng)度也較低。 在補(bǔ)料量相同的情況下，恒速流加蔗糖能取得更高的產(chǎn)酶量、底物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度，故最終采用恒速流加。

圖5 流加方式對(duì)L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響Fig. 5 Influence of feeding mode on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

表2 不同流加方式L-ASNase 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 2 Comparison of fermentation parameters among batches on different feeding mode

3結(jié) 語(yǔ)

在B. subtilis/ASNΔ25/B2 產(chǎn)L-ASNase 發(fā)酵過程中， 通過兩階段控制攪拌轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)策略即0 ～8 h 控制攪拌轉(zhuǎn)速700 r/min，8 h 以后攪拌轉(zhuǎn)速恒定在900 r/min，使菌體OD600、酶活和生產(chǎn)強(qiáng)度與恒定轉(zhuǎn)速600 r/min 相比， 分別提高了18.8%、31.9%、46.6%。 通過對(duì)補(bǔ)料時(shí)間、補(bǔ)料培養(yǎng)基組成、補(bǔ)料量、蔗糖流加方式的研究，得出：當(dāng)在16～28 h 以平均流速18.75 mL/h 恒速流加蔗糖、 以平均流速32 mL/h恒速流加酵母蛋白胨和玉米漿混合氮源時(shí)效果最好，OD600最高達(dá)到128.6，L-ASNase 酶活在48 h 達(dá)到最大1413.6 U/mL。和分批發(fā)酵相比，提高幅度高達(dá)66.2%。 和Khushoo[9]（870 U/mL）、 龍 水 清[10]（112.61 U/mL）、Chityala[11]（525.98 U/mL）等人報(bào)道的L-ASNase 產(chǎn)量相比，本研究的L-ASNase 最終產(chǎn)量高于目前報(bào)道的水平， 為實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)L-ASNase 工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支撐。